本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富,材料易得;二是鸡血细胞极易吸水胀破,而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心,对设备要求较高,操作繁琐,历时较长。
可以到市场售活鸡处索取鸡血,所带烧杯中必须提前放入抗凝剂柠檬酸钠溶液。具体制备方法如下。取质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液100 mL,置于500 mL烧杯中,注入新鲜的鸡血(约180 mL),同时用玻璃棒搅拌,使血液与柠檬酸钠溶液充分混合,以免血液凝结。将烧杯中的血液置于冰箱内,静置1 d,使血细胞自行沉淀。有条件的学校也可以将血液倒入离心管内进行离心,用2 000 r/min或3 000 r/min的转速,离心2 min,使血细胞沉淀于离心管底部,这样可以使血细胞沉淀更完全。用吸管除去上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞液。值得注意的是鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,所以在提取过程中为了减少DNA的损失,最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。
提取DNA的具体步骤
1.破碎细胞,释放DNA
鸡血细胞中的DNA与核蛋白结合,位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下是不会释放出来的。为了使DNA从细胞核中释放出来,需要向鸡血细胞液中加入蒸馏水,并且搅拌,从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌,但也不能太快太猛,防止打碎DNA。一般5~10 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水搅拌5 min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起,应用3~4层纱布进行过滤,除去一些颗粒较大的杂质。
2.溶解细胞核内的DNA
在浓度较高的NaCl溶液中核蛋白容易解聚,游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液,搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌,使DNA充分溶解。
3.DNA的析出
将溶液中的DNA与其他杂质分离,这一步骤是实验成败的关键。教材中列举了提取DNA的三种方案,本案例选取方案一。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度,使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水,并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌,以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量,使NaCl溶液的终浓度为0.1~0.2 mol/L。加水过程一般分三次进行,当总加水量为300 mL左右时,DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀,会使DNA分子又重新溶解。
用3~4层纱布对DNA稀释液进行过滤,滤去蛋白质,收集DNA的黏稠物。如果采用离心法,效果更好。用4 000 r/min转速的离心机,离心15 min,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。
4.DNA的初步纯化
如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质,或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范,都会导致实验现象不明显,常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色──白色。为了增进实验效果,需要对DNA粗制品进行简单的提纯,下面的方案可供参考。
将DNA黏稠物再溶解,继续用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物,仍旧沿一个方向不停搅拌3 min,使DNA充分溶解,以免损失。用3~4层纱布进行过滤(或离心),滤去杂质,收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50 mL预冷的体积分数为95%的乙醇,并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌,溶液中会出现DNA丝状物。
实验一般要求采用预冷的95%的乙醇,但对比结果显示,常温下的乙醇溶液也可产生明显效果。从理论上分析,预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性,防止DNA降解;二是降低分子运动,易于形成沉淀析出;三是低温有利于增加DNA分子柔韧性,减少断裂。此时悬浮于溶液中的DNA丝状物相对含杂质较少,如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分钟。
下面是图···
实验的乱七八糟
用品就差不多这些吧···
纯净水当蒸馏水用的,注射器是定吸管或者量筒,试管用来装提取出来的DNA2mol每升的食盐水,酒精还在冰箱塞着呢,这里没有···那个大碗是最后稀释时候用的,说是放烧杯里面玻璃会吸附DNA呃,所以我找了个碗···还有几个一次性杯子···
鸡血沉淀后就这个样子吧···
为啥我看别人的上层血浆都是黄的我的是红的呃···
用针管把上面的血浆(应该是吧···)吸出来。
吸取五毫升
加水搅拌过滤···
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