活体荧光材料——绿色荧光蛋白
    绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)能够自发发出荧光,它是第一个由生命自我复制、表达,并能够按照设计自动标记靶蛋白的特异性荧光探针。GFP是海洋生物水母Aequoria Victoria体内的一种发光蛋白,本身具有发光功能的荧光基团,发光过程无需特殊的辅助因子或其它蛋白大参与。
    GFP的独特之处在于它的受激发无种属特异性,产生荧光无需底物或辅助因子,并且与GFP融合表达的蛋白质在细胞内仍能发挥正常功能。现在已经证实,GFP是生物发光过程中能量转移的最后受体,可接受来自动物体内荧光素酶、氧化荧光素酶激发态复合物或转移钙依赖光蛋白释放的能量,从而发出绿色荧光。
    在近几年的生命科学研究中,GFP已经成为跟踪活细胞内基因表达及蛋白质定位标记物,成为基因转录调控、时相表达、蛋白质定位、转基因动物、细胞骨架等研究的有效手段。GFP在组织中表达产生内在自发的荧光,从而可以标记一些正常的细胞学过程,借助激光共聚焦显微镜等高分辨率的显微荧光光学仪器就可以监控、研究这些动态的过程。
    一、绿色荧光蛋白的发现
    1962年,普林斯顿大学的Osamu Shimomura和Frank Johnson到华盛顿州做海洋生物取样调查,收集了不少太平洋水母,他们试图了解多管水母为何具有发出生物荧光的特性。在维多利亚水母中他们发现这种生物荧光与Aequorin蛋白有关。由于提取的蛋白颗粒都是呈现绿色,就将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。后来纯化这些蛋白过程中,发现了一个在Aequorin蛋白周围的特别蛋白质,一种伴随蛋白(companion protein),这种蛋白在紫外光照射下发出高强度荧光绿,因此归类统称GFP。
    1992年,Prasher等人利用剪切DNA方法成功得到一段水母Aequorea victoria绿色荧光蛋白的cDNA序列。1994年,有研究者发现在其它生物体内表达的GFP不需要Aequorin蛋白或其它水母体内的要素相伴,一样可以发出绿光,他们证明了大肠杆菌(E. coli)或线虫(C. elegans)体内表达出的GFP在异于水母体内环境(没有伴随蛋白)下,同样在UV照射下发出绿光。于是这段cDNA序列就经常被应用到研究标记基因表达的追踪上。
    二、绿色荧光蛋白的结构特点与优势
图片1.jpg
    GFP是酸性蛋白,呈球柱状结构,直径3nm,长约4nm,分子量27-30kDa,含有238个氨基酸。来自不同动物的荧光蛋白的结构、性质不尽相同。目前研究较为深入的是来自多管水母科(aequoria)和海紫罗兰科(renilla)的绿色荧光蛋白,即Aequoria GFP和Renilla GFP。两种GFP有不同的激发光谱,Aequoria GFP在395nm具有最高吸收峰,肩峰为473nm;Renilla GFP在498nm具有强烈光吸收,肩峰为470nm。两种GFP发射光谱基本相同(508-509nm)。这说明两种蛋白质含有相同的生色团。
    1996年,Yang和Ormo两个研究小组分别独立发表有关绿色荧光蛋白GF,立体结构的成果,进一步揭开“绿光”的秘密。原来GFP像是一个灯笼,有一个圆桶的外壳,保护中心发光的荧光绿光芯。所有GFP都有一个由三条氨基酸链组成的内在荧光基团。从结构上看,GFP的折叠方式非常特殊,11条β桶状结构绕成一个圆柱体,一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位置,生色团附在α螺旋上,包埋于中心。由于GFP具有独特的β罐结构,因此它表现了以下一些特性:
    (1)性质稳定,不易变性。
    (2)生色团的光谱特性与它的包埋方式相关。
    (3)由于GFP的β罐表面两端结构有一定的柔性,因此GFP独特三维结构不会被融合蛋白破坏。
    (4)GFP与多种蛋白质N末端或C末端融合,不影响天然蛋白质特性。
    GFP的生色团位于序列64-69位,其序列中的65-67位残基分别是丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸(Ser65-Tyr66-Gly67),它们通过共价键形成一个稳定的环状三肽结构(对羟基苯甲基咪唑环酮),构成GFP生色团的核心。生色团刚好位于整个灯笼内的中心位置。
    GFP光谱特性是在UV激发下发出绿色荧光,最大激发波长在460-490nm,最高吸收峰值479nm;其绿色荧光发射光谱为500-550nm,其中最高峰位509nm,在540nm处有一个小峰。通常没有荧光淬灭现象。
    由于GFP分子量小,其融合不影响结合蛋白的生物学功能,转染的细胞可以继续传代。因此用来作一种直观、方便、有效的报告基因。将GFP与细胞内特定蛋白构建成融合蛋白基因,当融合蛋白在细胞中表达时,使特定蛋白得到荧光标记。各种细胞都能表达,因而作为活细胞的分子探针,GFP连接上目的基因后转染细胞,使用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜等仪器便可以观察分析目的基因的生物学功能与特性。GFP定位与免疫组化技术定位是目前广泛应用的蛋白质定位方法,而GFP技术相比后者优点更多。
    (1)GFP是一种可溶性蛋白,性质稳定,高温处理、甲醛固定、石蜡包埋、酸碱等对荧光性质无明显影响。稳定纯化的GFP蛋白能在65℃、pH值11、1%SDS和大部分蛋白酶环境中保持荧光性数小时。
    (2)荧光基团能够利用普通分子生物学工具简单加工到各种蛋白质序列上,进而在各种难于甚至不能进行显微注射的细胞类型和组织范围内表达荧光,荧光基团相当明亮。
    (3)荧光的表达不需要花费固定的时间,也无需组织加工的步骤。
    (4)由于不存在免疫试剂的部分或不完全进入的问题,GFP比免疫细胞化学方法可靠的多。
    (5)由于GFP及其多种突变体具有不同的光谱,因此可以对蛋白质进行共标记,并能对多重转基因细胞进行快速分辨。
    (6)表达GFP融合物的细胞能够在生活状态进行试验和检测。GFP作为报告基因与目的基因融合后对目的基因的结构和功能无影响,大量表达对细胞也无毒性,在细胞内仍能发挥正常的功能,细胞仍可连续传代培养,可对活细胞进行实时、定位观察,这经常被用于研究细胞内蛋白质转运、相互作用及其它一些动态变化,这是普通荧光染色或免疫荧光所无法做到的。
    鉴于以上各种特点,GFP就成为一个记号的体内原位、可检测蛋白相互作用的报告分子,是非常优秀的标记物,具有广泛的应用价值。
    三、荧光蛋白新进展
    1994年,华裔美国科学家钱永健(Roger Y Tsien)开始改造GFP,有多项发现。钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理,并对它进行了大刀阔斧的化学改造,不但大大增强了它的发光效率,有的可激活、可变色,还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白,使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱,供生物学家们选用。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种。近年来,到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好,现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。不过真发现的有用东西并不很多。成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白,包括红色荧光蛋白。
    (1)DsRed是在珊瑚礁中发现的橙红色荧光蛋白,其第二激发光谱吸收峰在553nm处,恰好超过叶绿素b激发光谱吸收峰,克服了GFP影响植物生长的负面作用。
    (2)我国研究人员完成的863计划项目在厦门水域水母中获得了第二种野生型GFP基因,发射光谱近橙色。
    (3)Vitality hrGFP II是第二代人源化绿色荧光蛋白,激发和发射光谱更窄,更易被检测。稳定性和毒性指标更加。
    (4)随时间变色的荧光蛋白——Fluorescent Timer,能随时间延长而由绿色变为红色,变色时间大约为3h。这种颜色可变的荧光蛋白为实时研究启动子的调控时效提供了可能:在活细胞或者活生物体内,不但可以看到某个启动子什么时候、在什么位置开始启动基因表达,还可以观察到它什么时候关闭表达。
    (5)其它突变体,目前还有克隆自珊瑚和海葵的红色荧光蛋白(red fluorescent proteins, RFG),以及来自其它物种的黄色荧光蛋白(yellow fluorescent proteins, YFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent proteins, CFP)、蓝色荧光蛋白(blue fluorescent proteins, BFP)。
    四、应用
    (1)作为转基因植物和动物的筛选标记
    在植物系统中, GFP 已被广泛用作基因转移的报道分子。Chiu W L, Niwa Y 等人用突变型GFP( S65T ) 转化拟南芥获得成功; Vain P, Worland B等人用基因枪方法转化水稻未成熟胚, 通过愈伤组织再生得到转基因植株; Sheen J, Hwang S 等人的研究表明, 在植物原生质体的流式细胞计量分选技术中, GFP 可作为报道分子对阳性克隆进行筛选。GFP 应用于动物成体的研究才刚刚起步, 目前主要是作为转基因动物研究中的报告分子, 用来标记外源基因在导入动物胚胎或卵后在成体中的表达。
    (2)用于定位标记
    GFP 的相对分子质量小, 能与多种不同的蛋白质N 端或C 端融合而保持其天然蛋白质的特性, 可特异地进行蛋白质及细胞器的定位研究。大量实验表明, GFP 可定位到细胞核、细胞骨架、叶绿体、线粒体等细胞器中。另外, 将GFP 作为活细胞内蛋白质的标记分子, 利用荧光共振能量转移显微术可以研究细胞内蛋白质之间的相互作用。近年来, 该方法与荧光寿命成像显微术结合形成荧光共振能量转移-荧光寿命成像显微术, 得到了广泛应用。
    (3)跟踪观察微生物
    传统方法中, 一般用荧光染料标记微生物, 由于微生物的分裂, 染料被稀释, 因此长期以来未能观察到微生物侵入活细胞的实时动态过程。GFP 基因能克服上述缺点, 且在活细胞中能直接观察到, 无需破坏原有细胞而阻止感染的继续进行。目前, 这项成果已经运用于烟草植株中的病毒、玉米植株中的固氮菌等的研究试验中。
    (4)发育机理研究
    GFP 作为活体标记物, 可用于示踪细胞发育过程中基因表达的变化情况, 对于那些透明的动物, 还可观察其发育过程。如查尔菲( Chalfie) 等用线虫meo27 基因( 编码B2T ubulin) 启动子控制基因转化线虫(C. elegans) , 发现GFP 可在特定的神经元中表达, 并且可以非常方便地检测到。
    (5)用于细胞筛选
    利用细胞表面标记, 通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪, 可以分离与纯化特殊类型的细胞; 同时还可利用不同颜色GFP 衍生物标记相关蛋白质, 来观察在单细胞内相互作用的靶细胞, 再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细胞, 从而可方便地用于大规模筛选新的药物。
    (6)用于免疫学
    可采用基因工程的方法生产GFP 标记的抗原或抗体, 以取代传统的免疫学标记方法, 建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。它比一般的标记物有如下优点: 对光稳定; 对抗原或抗体的标记率可达100% ; 因是直接的抗原抗体反应, 无需再添加任何底物, 可以避免非抗原抗体结合的背景干扰等。
目前,GFP 正受到科学界越来越广泛的关注,经过改造后的GFP 不仅能够在动植物中正常表达,而且荧光信号大大加强,方便了人们对反应结果的检测及对反应过程的监测。GFP 作为一种新的报告基因和遗传标记物被广泛地应用于现代生命科学研究之中,成为了寻找药物作用靶标和筛选新药的重要工具,它对于人类在未来攻克神经方面疾病、癌症等具有重要的意义。
来自:综合交流区 / 科创茶话
8
cl520
10年3个月前
1楼
楼主  这是从哪抄来的资料  也敢往上抄[s:274]
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小龙
10年3个月前
2楼
回 1楼(cl520) 的帖子
楼上别瞎说哦。。。楼主就是研究这个的
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diy患者
10年3个月前
3楼
如果是原创的话,是写的不错的综述。
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红姐
10年3个月前
4楼
写得不错。楼主给力哟
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phpskycn
10年3个月前
5楼
这是楼主写的论文么?
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liumingabc
10年1个月前
6楼
不管是自己写的,还是抄的,从内容上看是真不错。[s:230]
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sfwjsxg
9年8个月前
7楼
楼主写的不错~
我也是干这个的,现在实验室里面做免疫荧光时用gfp转染活细胞已经非常普通了,操作也方便,荧光显微镜镜检也方便~
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