折叠的有点厉害，这里重新贴出来，虽然读起来还是有点难受：
我们正在设计一段寡核苷酸序列，用于将目标基因克隆到pet30a(+)载体中。 目标基因序列：atgaacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 载体pet30a(+)的多克隆位点（MCS）位于NdeI和EcoRI酶切位点之间。因此，我们需要在目标序列的两端分别添加NdeI和EcoRI的识别序列。 注意：NdeI的识别序列是5'-CATATG-3'，切割位置在CA与TATG之间（即5'端产生CATG，3'端产生AT）。但实际使用中，我们通常将目标基因的起始密码子ATG嵌入在NdeI位点中（即CATATG中的ATG就是起始密码子）。 而EcoRI的识别序列是5'-GAATTC-3'，切割后产生5'突出末端（G和AATTC）。 设计步骤： 1. 在目标序列的5'端添加NdeI位点。由于目标序列本身以“atg”开头（即起始密码子），因此我们可以在前面加上“ca”，形成完整的NdeI位点“catatg”。但是注意，这样添加后，起始密码子仍然是目标序列自带的第一个“atg”（即“catatg”中的“atg”）。所以5'端添加的序列应该是“ca”（注意：这样添加后，目标基因的起始密码子就位于NdeI位点内部了）。 2. 在目标序列的3'端添加EcoRI位点。由于EcoRI位点不会干扰终止密码子（但我们目标序列没有终止密码子，所以需要根据情况考虑是否添加终止密码子，不过题目没有要求，且pet30a(+)载体本身在终止密码子之前有His标签，所以我们的目标基因应该不带终止密码子，这样His标签才能表达）。因此，我们直接在3'端添加EcoRI位点“gaattc”（注意：EcoRI位点添加后，会紧接在目标基因后面，然后后面是载体上的序列，包括终止密码子等。所以这里我们不需要添加终止密码子）。 然而，需要注意的是，在3'端添加酶切位点时，为了避免移码，我们需要确保添加后阅读框正确。但因为我们添加的是在终止密码子之前，而且载体上终止密码子是在多克隆位点之后，所以只要目标基因的阅读框正确，添加酶切位点不会影响终止密码子。 但是，在添加酶切位点时，我们通常会在酶切位点之外再添加几个保护碱基，以提高酶切效率。根据常规，保护碱基通常为3-4个。不同的酶对保护碱基的要求不同，我们可以参考NEB（New England Biolabs）的推荐。 对于NdeI（CATATG），根据NEB的推荐，保护碱基要求如下： - 在5'端至少加1个碱基（即保护碱基），但通常我们加3-4个。不过，由于我们前面要添加保护碱基，同时又要保证起始密码子ATG在NdeI位点中，所以我们在“ca”前面再添加保护碱基。但是注意，NdeI位点本身已经包含了起始密码子，所以保护碱基加在“catatg”的前面。例如，我们可以在5'端添加3个碱基作为保护，比如“ccc”，那么5'端就是“cccatatg”，然后紧接着目标序列（去掉第一个atg，因为NdeI位点中的atg就是起始密码子？不，目标序列的第一个碱基就是atg，所以我们实际上是在目标序列的atg前面加上“ca”，形成“catatg”，然后在这个“catatg”前面再加保护碱基？这样就会多出一个atg？） 重新考虑：目标序列的第一个碱基是“a”（atgaac...），如果我们直接在前面加“ca”，那么序列变成“catgaac...”。这样，NdeI位点是“catatg”，但我们这里形成的是“catg”，并不匹配。所以我们需要将目标序列的第一个“atg”中的“a”作为NdeI位点中的“g”后面的那个“a”吗？不对。 正确的做法是：我们要将目标基因的起始密码子（ATG）嵌入到NdeI位点中，即NdeI位点应该是“CATATG”，其中“ATG”就是起始密码子。所以目标基因的5'端必须是“ATG”开始。而我们的目标序列正是以“atg”开始（即atgaac...），所以我们只需要在目标序列的5'端前面加上“CA”两个碱基，形成“CA” + “ATG” = “CATG”，但这样并不构成NdeI位点（NdeI是CATATG）。因此，我们还需要在“CA”和“ATG”之间插入“TAT”吗？不对，这样会改变编码。 实际上，正确的做法是：我们不需要在目标基因的ATG前面加CA，而是将目标基因的ATG作为NdeI位点的一部分。所以我们在目标基因ATG前面加上“CAT”，形成“CAT” + “ATG” = “CATATG”（即NdeI位点）。但是这样目标基因的起始密码子就变成了第二个ATG？不对，因为目标基因的ATG还是第一个，而我们在前面添加的CAT会形成一个额外的甲硫氨酸（如果翻译的话）？这样不行。 让我们重新设计：我们想要的是在目标基因的ATG前面加上两个碱基（CA）和一个额外的T？这样不行，因为这样会改变阅读框。 实际上，标准做法是：在目标基因的5'端设计引物时，将NdeI位点设计为：5'- (保护碱基) + CATATG + 目标基因（去掉起始密码子ATG）... -3'。但是我们的目标基因本身带有起始密码子ATG，所以我们可以保留这个ATG，而将NdeI位点设计为：5'- (保护碱基) + CATATG + 目标基因（去掉第一个ATG）... -3'？这样也不行，因为目标基因的第一个ATG被去掉了，那么起始密码子就由NdeI位点中的ATG提供。但是，我们的目标基因序列是从“atg”开始的，如果我们去掉第一个atg，那么目标基因就会从第二个碱基开始，这样就会改变氨基酸序列。 因此，更常见的做法是：目标基因的5'端引物设计为：5'- (保护碱基) + CATATG + 目标基因（从起始密码子ATG之后开始）... -3'。这样，目标基因的起始密码子由NdeI位点中的ATG提供，而目标基因本身的ATG被去掉（即从第二个碱基开始）。但是，这样目标基因的第二个密码子就会由目标基因的第二个密码子开始，而第一个密码子（即起始密码子）由CATATG中的ATG提供。所以我们需要将目标基因的第一个密码子（在ATG后面的那个密码子）作为第二个密码子，而起始密码子由酶切位点提供。 然而，我们这里的目标基因序列是：atgaacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 第一个密码子：atg -> 甲硫氨酸（Met） 第二个密码子：aac -> 天冬酰胺（Asn） 如果我们去掉第一个atg，那么序列变成：aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 然后在前面加上CATATG，那么整个序列变成：CATATG + aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 这样，翻译时，CATATG中的ATG作为起始密码子（Met），然后紧接着aac（Asn）...，所以氨基酸序列是：Met-Asn-Leu-Ile-Asp-Cys-Cys-Glu-Ile-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Phe-Gly-Cys-Leu-Asn ... 而原来的氨基酸序列是：Met-Asn-Leu-Ile-Asp-Cys-Cys-Glu-Ile-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Phe-Gly-Cys-Leu-Asn ... 所以这样设计后，氨基酸序列与原来完全相同。 因此，我们可以在5'端设计为：保护碱基 + CATATG + 目标基因（去掉第一个atg后的剩余部分）。 3'端设计：在目标基因的3'端添加EcoRI位点（GAATTC），注意要添加保护碱基。另外，由于EcoRI位点添加后，会紧接在目标基因的后面，所以我们需要在目标基因的终止密码子之前（但这里没有终止密码子，所以直接添加）。同时，为了保持阅读框，我们添加的位点不能破坏阅读框。由于EcoRI位点（GAATTC）的阅读框是：GAA TTC，所以我们需要确保添加后，目标基因的最后一个密码子后面直接跟的是GAATTC，并且这个GAATTC不会导致移码。 但是，我们添加EcoRI位点是在目标基因的后面，所以它不会影响目标基因的编码。但是，当我们用EcoRI切割后，会形成粘性末端，与载体的EcoRI位点连接。载体上的EcoRI位点后面紧跟着终止密码子（在pet30a(+)中，多克隆位点后面有终止密码子）。 所以，3'端的设计：目标基因（不带终止密码子） + 保护碱基 + GAATTC（EcoRI位点）。 但是，我们添加保护碱基时，也要注意阅读框。因为EcoRI位点有6个碱基，所以我们需要在目标基因的后面直接添加EcoRI位点（不添加额外的碱基）？不行，因为需要保护碱基。所以我们在EcoRI位点后面再添加几个碱基（作为保护）？实际上，我们是在引物的5'端添加保护碱基，而3'端引物是反向互补的。所以设计3'端引物时，我们会在5'端加上保护碱基和EcoRI位点，然后接着是目标基因（反向互补序列）。 具体设计： 5'端引物（正向引物）： 保护碱基（根据NEB推荐，NdeI需要5'端至少1个碱基，但通常加3-4个，这里我们加3个） + CATATG + 目标基因（去掉第一个atg后的序列） 目标基因去掉第一个atg后：aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 所以正向引物：5'- [保护碱基] + CATATG + aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac -3' 但是，这里我们还没有确定保护碱基。根据NEB的推荐，对于NdeI，在5'端添加3个碱基可以提高切割效率。常用的保护碱基可以是任意碱基，但避免形成二级结构。我们这里选择“CCC”作为保护碱基（也可以选择其他，但CCC在后续测序中比较稳定）。 所以正向引物：5'- CCC CATATG aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac -3' 注意：CATATG是连续的，所以写成：5'-CCC CATATG aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac-3' 3'端引物（反向引物）： 设计反向引物时，我们需要在5'端添加保护碱基和EcoRI位点，然后接着是目标基因（反向互补序列，且不包含终止密码子）。 目标基因（原始序列，包括起始密码子）为：atgaacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 由于我们设计正向引物时去掉了起始密码子（第一个atg），所以目标基因序列变为：aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 但是，在反向引物中，我们需要的是整个目标基因（包括起始密码子？不，在正向引物中我们已经用CATATG提供了起始密码子，所以目标基因是从aac开始的，所以反向引物应该覆盖从aac开始到最后的序列）的反向互补。 因此，反向引物对应的目标基因序列是：aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 其反向互补序列为：gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt -> 注意，DNA序列反向互补，从3'到5'。 然后，我们在反向互补序列的5'端添加EcoRI位点（注意：EcoRI位点是GAATTC，在反向引物中，我们添加的应该是该位点的反向互补序列（即GAATTC的反向互补是GAATTC吗？不对，GAATTC的反向互补是GAATTC（因为EcoRI是回文序列）？不对，回文序列的反向互补是它本身，但方向相反。在反向引物中，我们添加的EcoRI位点应该是正向的GAATTC，因为当我们用反向引物扩增时，会在目标基因的3'端加上GAATTC（在PCR产物的末端），这样PCR产物的3'端就是GAATTC（然后反向引物5'端再添加保护碱基）。但是，由于反向引物是从3'到5'方向与模板结合，所以引物的5'端对应PCR产物的5'端。因此，我们在反向引物的5'端加上保护碱基和EcoRI位点（GAATTC），这样PCR产物的3'端就会包含EcoRI位点（因为PCR产物是双链，其另一条链的5'端就是反向引物的序列，而EcoRI位点就会出现在PCR产物的两端？不对，我们这里只加在3'端）。 具体来说，我们设计反向引物时，引物序列为：5'- [保护碱基] + GAATTC + 目标基因（反向互补序列) -3' 但是，这样设计后，PCR产物的3'端（即与反向引物结合的那条链的3'端）会包含EcoRI位点吗？实际上，PCR产物的两端分别是正向引物和反向引物。反向引物结合在模板的3'端，所以扩增出的新链的5'端就是反向引物的序列（从5'到3'方向）。因此，在PCR产物的双链中，一条链的5'端是正向引物（包括保护碱基、NdeI位点、目标基因），另一条链的5'端是反向引物（包括保护碱基、EcoRI位点、目标基因的反向互补序列）。这样，当我们用NdeI和EcoRI双酶切PCR产物时，就会在两端产生相应的粘性末端。 所以反向引物：5'- [保护碱基] + GAATTC + 目标基因（去掉起始密码子后的序列）的反向互补序列 -3' 目标基因（去掉起始密码子）的序列：aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 反向互补序列：计算如下： 原始序列（去掉起始密码子后）: 5'- aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac -3' 反向互补：3'- ttggactaactaacgacgctttaaacgacgttgggccgcacgaaaccgacggacttg -5' 写成5'到3'：5'- gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt -3' （注意：这里我们只需要计算目标基因（去掉起始密码子）的部分，即从aac开始到末尾，所以反向互补序列应该从aac的互补碱基开始，一直到ac的互补碱基。但是注意，原始序列的最后三个碱基是gaa，所以反向互补的最后三个碱基是ttc？不对，我们重新计算： 原始序列（去掉起始密码子）：aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac 反向：从3'端开始：c a a g t c c g c a g g c c a a a g c a c g c c g g g t t g c a g c a a a t t t c g c a g c a a t c a a t c a g g t t （注意：反向序列应该是从3'到5'，所以写5'到3'时就是上面这个字符串的反向？不对） 重新计算反向互补： 原始序列（5'->3'）: a a c c t g a t t g a t t g c t g c g a a a t t t g c t g c a a c c c g g c g t g c t t t g g c t g c c t g a a c 互补序列（3'->5'）: t t g g a c t a a c t a a c g a c g c t t t a a a c g a c g t t g g g c c g c a c g a a a c c g a c g g a c t t g 将互补序列从5'->3'写：g t t c a g g c a g c c a a a g c a c g c c g g g t t g c a g c a a a t t t c g c a g c a a t c a a t c a g g t t （注意：这里最后是gtt，因为原始序列开头是aac，所以互补是ttg，然后反向互补序列5'端应该是gttcagg...，因为原始序列最后是gaac，互补是cttg，然后反向就是gttc？不对） 我们按照碱基互补配对： 原始序列（5'->3'）: a a c c t g a t t g a t t g c t g c g a a a t t t g c t g c a a c c c g g c g t g c t t t g g c t g c c t g a a c 互补配对：A-T, C-G, G-C, T-A 所以互补链（与原始序列反向平行）： 3'->5': T T G G A C T A A C T A A C G A C G C T T T A A A C G A C G T T G G G C C G C A C G A A A C C G A C G G A C T T G 写成5'->3': G T T C A G G C A G C C A A A G C A C G C C G G G T T G C A G C A A A T T T C G C A G C A A T C A A T C A G G T T （注意：从3'端开始是GTT CAG ...，所以5'端开始就是GTT CAG ...） 但是，我们仔细检查： 原始序列最后3个碱基：g a a c -> 互补：c t t g -> 反向互补链的5'端应该是gttc（因为c t t g反向就是g t t c）？不对，我们这样看： 原始序列最后是：... c t g a a c（即最后6个碱基是ctgaac） 互补链：... g a c t t g（互补链与原始序列反向平行，所以原始序列的5'->3'对应互补链的3'->5'。因此，原始序列的最后6个碱基（3'端）是ctgaac，那么互补链的5'端就是gttcag（因为c->g, t->a, g->c, a->t, a->t, c->g，然后反向？不对，互补链的5'端对应原始序列3'端的互补碱基，所以原始序列3'端是c，互补链5'端就是g；倒数第二个是a，互补链5'端第二个就是t；倒数第三个是a，互补链第三个是t；倒数第四个是c，互补链第四个是g；倒数第五个是t，互补链第五个是a；倒数第六个是g，互补链第六个是c。所以互补链5'端前6个碱基是：g t t c a g） 因此，反向互补序列（5'->3'）应该是：gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt 所以反向引物：5'- [保护碱基] + GAATTC + gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt -3' 保护碱基：对于EcoRI，NEB推荐在5'端加3个碱基，我们同样用“CCC”。 所以反向引物：5'- CCC GAATTC gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt -3' 但是，我们还需要注意：反向引物中GAATTC的添加，可能会在目标基因的3'端引入额外的氨基酸。因为目标基因的最后一个密码子后面直接接上了GAATTC。在翻译时，GAATTC会被翻译成氨基酸：GAA（谷氨酸）和TTC（苯丙氨酸）。所以我们需要确保目标基因的阅读框正确，并且添加的GAATTC不会导致移码。由于我们添加的GAATTC是在目标基因的后面，而目标基因的最后一个密码子（由原始序列的最后一个密码子决定）后面直接就是GAATTC，所以会多出两个氨基酸（谷氨酸和苯丙氨酸）。但这样并不符合要求，因为我们的目标基因后面应该直接接上载体上的His标签和终止密码子。所以实际上，我们不应该在目标基因后面添加额外的氨基酸。 因此，我们需要调整：在3'端添加EcoRI位点的时候，要确保不引入额外的氨基酸，即要保证EcoRI位点不会破坏终止密码子。但是，我们的目标基因本身没有终止密码子，所以载体上的终止密码子会在EcoRI位点之后（载体上多克隆位点之后有终止密码子）。而我们在目标基因和EcoRI位点之间没有终止密码子，所以目标基因会一直翻译到EcoRI位点，然后继续翻译载体上的序列，直到遇到终止密码子。这样，目标蛋白的C端就会多出几个氨基酸（由EcoRI位点编码的氨基酸和载体上的序列编码的氨基酸）。这是通常的做法，因为His标签等需要融合表达。 但是，如果我们不想在目标基因后面添加额外的氨基酸，那么我们就需要在目标基因的终止密码子后面添加EcoRI位点。但是题目没有要求终止密码子，所以我们按照常规，不添加终止密码子，直接添加EcoRI位点，这样载体上的终止密码子会起作用。 然而，我们添加的EcoRI位点（GAATTC）会被翻译成：Glu-Phe（谷氨酸-苯丙氨酸）。所以目标蛋白的C端会多出两个氨基酸。如果不想多出这两个氨基酸，我们可以调整阅读框，使得目标基因的最后一个密码子后面紧跟着终止密码子。但题目没有要求，我们按照常规操作。 总结： 正向引物：5'- CCC CATATG aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac -3' 反向引物：5'- CCC GAATTC gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt -3' 但是，我们还需要验证阅读框： 正向引物：CCC CATATG aac ctg att gat tgc tgc gaa att tgc tgc aac ccg gcg tgc ttt ggc tgc ctg aac 翻译：从CATATG中的ATG开始：Met - Asn - Leu - Ile - Asp - Cys - Cys - Glu - Ile - Cys - Cys - Asn - Pro - Ala - Cys - Phe - Gly - Cys - Leu - Asn ... 而原始目标基因（包括起始密码子）：atg aac ctg att gat tgc tgc gaa att tgc tgc aac ccg gcg tgc ttt ggc tgc ctg aac -> Met - Asn - Leu - Ile - Asp - Cys - Cys - Glu - Ile - Cys - Cys - Asn - Pro - Ala - Cys - Phe - Gly - Cys - Leu - Asn 所以氨基酸序列一致。 反向引物：CCC GAATTC gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt 这个引物扩增出的链的3'端对应目标基因的3'端（即原始序列的3'端），所以目标基因的最后三个密码子（从后往前）：aac -> Asn，ctg -> Leu，gc -> 不完整？不对，目标基因的序列长度是3的倍数吗？ 原始目标基因（包括起始密码子）的长度：我们数一下： atg aac ctg att gat tgc tgc gaa att tgc tgc aac ccg gcg tgc ttt ggc tgc ctg aac -> 共21个密码子，63个碱基。 去掉起始密码子（atg）后，序列为：aac ctg ... aac （共60个碱基，20个密码子）。 所以目标基因的最后一个密码子是aac（Asn），然后我们添加了EcoRI位点（GAATTC），所以整个序列最后是aacGAATTC。在翻译时，aac（Asn）后面是GAA（谷氨酸）和TTC（苯丙氨酸），然后后面是载体的序列（包括终止密码子）。 因此，设计完成。 但是，我们还需要考虑酶切位点的保护碱基是否足够。这里我们添加了3个C（CCC）作为保护碱基，对于NdeI和EcoRI来说，3个保护碱基通常是足够的。 最后，我们设计的引物序列： 正向引物：5'-CCC CATATG aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac-3' 反向引物：5'-CCC GAATTC gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt-3' 注意：实际合成引物时，保护碱基和酶切位点都是小写字母还是大写？通常，保护碱基和酶切位点用大写，而基因序列部分用小写，但也可以全部用大写。这里我们按照常规，全部用大写。 因此： 正向引物：5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 反向引物：5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 但是，我们注意到正向引物中，CATATG前面是CCC，所以连起来是CCCCATATG，这是4个C，但没关系。 另外，反向引物中，GAATTC前面是CCC，连起来是CCCGAATTC。 这样，我们设计的引物就可以用于扩增目标基因（不包括起始密码子，因为起始密码子由NdeI位点提供），并在两端分别引入NdeI和EcoRI酶切位点。 扩增出的PCR产物： 5'-CCCCATATG + 目标基因（60bp） + GAATTC + CCC-3' ？不对，PCR产物的两条链分别是： 链1（与正向引物相同）：5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 链2（与反向引物互补）：3'-GGGGTATACTTGGACTAACTAACGACGCTTTAAACGACGTTGGGCCGCACGAAACCGACGGACTTG-5' （注意，反向引物结合在链2上，所以链2的5'端是反向引物的互补序列） 实际上，PCR产物双链： 5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 3'-GGGGTATACTTGGACTAACTAACGACGCTTTAAACGACGTTGGGCCGCACGAAACCGACGGACTTG-5' 但是，我们反向引物序列是5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3'，它的互补链是： 3'-GGGCTTAAGCAAGTCCGTCGGTTTCGTGCGGCCCAACGTCGTTTAAGCGTCGTTAGTTAGTCCAA-5' 所以，我们扩增出的PCR产物应该是： 5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 3'-GGGCTTAAGCAAGTCCGTCGGTTTCGTGCGGCCCAACGTCGTTTAAGCGTCGTTAGTTAGTCCAA-5' 这显然不对，因为两条链长度不同。错误在于：反向引物设计时，目标基因的反向互补序列计算有误。 重新计算目标基因（去掉起始密码子）的反向互补序列： 目标基因序列（60bp）: 5'-AACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 反向互补序列：3'-TTGGACTAACTAACGACGCTTTAAACGACGTTGGGCCGCACGAAACCGACGGACTTG-5' 写成5'->3': 5'-GTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 所以反向引物应该是：5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 这样，PCR产物的双链： 正向链：5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 反向链：5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 的互补链，即： 3'-GGGCTTAAGCAAGTCCGTCGGTTTCGTGCGGCCCAACGTCGTTTAAGCGTCGTTAGTTAGTCCAA-5' 但是，这仍然不对，因为反向链的5'端应该是与正向链的3'端互补。所以实际上，反向链的序列应该是： 3'-GGGGTATACTTGGACTAACTAACGACGCTTTAAACGACGTTGGGCCGCACGAAACCGACGGACTTG-5' 然后在其3'端加上：...GAATTC-CCC（互补）-> 不对，我们重新考虑PCR产物的形成。 正确的PCR产物双链应该是： 链A（由正向引物延伸而来）： 5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 链B（由反向引物延伸而来）： 5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 但是，链A和链B并不是互补的。实际上，链A和链B的互补链才是配对的。 我们应该这样理解： 模板链是双链DNA（假设是双链，但题目只给了一条链，我们假设另一条链是互补的）。 正向引物结合在模板链的5'端（即题目给出的链），所以延伸出的新链与模板链互补，即与题目给出的链互补。 反向引物结合在模板链的3'端（即题目给出链的互补链）的3'端，所以延伸出的新链与模板链的互补链互补，即与题目给出的链相同。 因此，PCR产物中： 一条链（与题目给出的链相同，但两端加了引物）： 5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 另一条链（与题目给出的链互补，但两端加了引物）： 3'-GGGGTATACTTGGACTAACTAACGACGCTTTAAACGACGTTGGGCCGCACGAAACCGACGGACTTG-5' 而反向引物序列是5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3'，它的互补链是： 3'-GGGCTTAAGCAAGTCCGTCGGTTTCGTGCGGCCCAACGTCGTTTAAGCGTCGTTAGTTAGTCCAA-5' 这里我们发现，我们设计的反向引物并不与模板链的3'端互补？这是因为我们设计反向引物时，是直接以题目给出的链的互补链作为模板的。所以反向引物应该与题目给出链的3'端互补。 题目给出的链（目标基因，包括起始密码子）：5'-atgaacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac-3' 其3'端序列：...ctgcctgaac-3' 反向引物应该与3'端互补，即反向引物序列应该与3'端（gaac）前面的序列（即整个目标基因的3'端部分）互补，并且我们在5'端添加保护碱基和酶切位点。 所以反向引物设计为：5'-CCCGAATTC + 题目给出链的3'端（去掉最后三个碱基？不，我们设计的是去掉起始密码子的目标基因，所以题目给出链去掉起始密码子后为：5'-aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac-3'，那么其3'端就是...ctgcctgaac-3'，所以反向引物应该与gaac前面的序列（即ctgcctgaac）互补。但是，我们设计反向引物时，应该覆盖整个去掉起始密码子后的目标基因序列，即从5'端aac到3'端gaac。 所以，反向引物应该是：5'-CCCGAATTC + (aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac)的反向互补序列 这个反向互补序列就是：5'-GTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' （注意，这是60个碱基） 所以反向引物：5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 现在，PCR产物的两条链： 链1（与题目给出链去掉起始密码子后的序列相同，但5'端加了CCCCATATG）： 5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 链2（与链1互补）： 3'-GGGGTATACTTGGACTAACTAACGACGCTTTAAACGACGTTGGGCCGCACGAAACCGACGGACTTG-5' 但是，链2的5'端应该是反向引物的互补序列，即反向引物的互补序列应该是链2的5'端。 反向引物：5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 其互补序列：3'-GGGCTTAAGCAAGTCCGTCGGTTTCGTGCGGCCCAACGTCGTTTAAGCGTCGTTAGTTAGTCCAA-5' 所以，链2的5'端应该是这个互补序列吗？但是长度不对（链2应该60个碱基，加上保护碱基和酶切位点，一共60+6+3=69？）。而且，链1的长度为：4（CCCC）+6（CATATG）+60（目标基因）=70bp，而链2的长度为：3（CCC）+6（GAATTC）+60（目标基因的反向互补）=69bp，所以长度不一致。 错误在于：我们设计正向引物时，保护碱基是CCC（3个）和CATATG（6个），所以一共9个碱基，然后接60个碱基的目标基因，共69个碱基。 反向引物：保护碱基CCC（3个）+GAATTC（6个）+60个碱基（反向互补序列），共69个碱基。 所以PCR产物应该是69bp的双链。但实际上，双链DNA的两条链长度应该相等。这里正向引物延伸的链长度是69bp，反向引物延伸的链长度也是69bp，所以双链长度一致。 链1：5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' （69nt） 链2：5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' （69nt） 但是，这两条链并不互补！它们应该是互补的吗？不，它们不是互补的，因为它们扩增自模板链的两条链。实际上，链1和链2的互补链才形成双链。 链2的互补链：3'-GGGCTTAAGCAAGTCCGTCGGTTTCGTGCGGCCCAACGTCGTTTAAGCGTCGTTAGTTAGTCCAA-5' 那么链1和链2的互补链是否互补？ 链1：5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 链2的互补链：3'-GGGCTTAAGCAAGTCCGTCGGTTTCGTGCGGCCCAACGTCGTTTAAGCGTCGTTAGTTAGTCCAA-5' 我们检查中间部分： 链1: GAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC 链2互补链：... CAAGTCCGTCGGTTTCGTGCGGCCCAACGTCGTTTAAGCGTCGTTAGTTAGTCCAA ... 它们并不互补。这说明我们的反向引物设计有误。 重新设计反向引物： 目标基因（去掉起始密码子）的序列：5'-AACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 其反向互补序列（作为反向引物的3'端部分）应该是：5'-GTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 所以反向引物：5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 现在，用这个反向引物去扩增，得到的PCR产物中，由反向引物延伸出的链（记为链B）的序列就是反向引物的序列吗？不是。反向引物只是作为引物，结合在模板上，然后延伸。所以链B的5'端是反向引物的序列，而3'端是依据模板合成的序列。由于模板是题目给出 strand. 重新考虑：题目给出的链（记为 Template +）: 5'-atgaacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac-3' （63nt） 其互补链（Template -）: 3'-tacttggactaactaacgacgctttaaacgacgttgggccgcacgaaaccgacggacttg-5' （63nt） 正向引物（F）: 5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' = 5'-CCCCATATG + [Template+的第4-63位] -> 5'-CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAAC-3' 正向引物 F 与 Template+ 的5'端 complementary吗？ Template+ 的5'端：5'-atg aac ctg... -> 去掉 atg 后，5'-aac ctg... 正向引物去掉保护碱基和酶切位点的部分：AACCTG... -> 与Template+的5'端（去掉atg）一致，所以正向引物会结合在Template+上。 反向引物（R）: 5'-CCCGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' Template- 的序列（5'->3'）: 5'-GTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' （注意，Template-的5'端是 Template+的3'端的互补序列，即Template+的3'端是 gaac -> Template-的5'端 complementary to gaac is CTTG? wait, we need to write Template- in 5'->3'). Template+的3'端：ctgcctgaac -> 3' end: ...c t g c c t g a a c-3' Template-的5'端（ complementary to the 3' end of Template+）：5'-g a c g g a c t t g-3' -> 5'-GACGGACTTG-3' 而反向引物的3'端是：...CAGGTT-3' -> 这应该 complementary to Template-的5'端吗？ 反向引物的3'端：CAGGTT-3' -> complementary to Template-的 sequence should be GTCCAAG-> not match. 正确设计：反向引物的3'端必须与Template-的3'端 complementary，这样才会结合在Template-上，然后向5'端延伸。 Template-的3'端： complementary to Template+的5'端（ atg aac -> complementary: tac ttg -> in 5'->3': complementary sequence is 5'-caagta-3'? -> no. 我们写出Template-的序列（5'->3'）: complementary to Template+. Template+ : 5'-atgaacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac-3' Template- : 5'-tacttggactaactaacgacgctttaaacgacgttgggccgcacgaaaccgacggacttg-3' -> wait, this is not correct because the length should be the same. 正确计算Template-: Template+ : 5'-atgaacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac-3' Template- : 3'-tacttggactaactaacgacgctttaaacgacgttgggccgcacgaaaccgacggacttg-5' Then in 5'->3': Template- = 5'-gttcaggcagccaaagcacgccgggttgcagcaaatttcgcagcaatcaatcaggtt-3' -> because the reverse of the complementary sequence. 所以，Template- in 5'->3' is: 5'-GTTCAGGCAGCCAAAGCACGCCGGGTTGCAGCAAATTCGCAGCAATCAATCAGGTT-3' 这正是我们之前计算的目标基因（去掉起始密码子）的反向互补序列。所以反向引物的3'端部分（GTTCAGGCAGCCAAAGCACG�
为了将目标蛋白质DNA序列克隆到pET30a(+)载体中，需要在两端添加特定的限制性内切酶识别序列。pET30a(+)的多克隆位点（MCS）位于NdeI（5'-CATATG-3'）和EcoRI（5'-GAATTC-3'）酶切位点之间。设计如下：
### 原始目标序列（63 bp）：
```
atgaacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac
```
### 设计后的序列（两端添加酶切位点及保护碱基）：
- 5'端：添加NdeI位点（CATATG），其中包含起始密码子ATG。目标序列原有的起始密码子`atg`将被整合进NdeI位点，因此需移除序列开头的`atg`，并在其前方添加`CAT`形成完整的NdeI位点（CATATG）。同时，添加保护碱基`CCC`（提高酶切效率）。
- 3'端：添加EcoRI位点（GAATTC）及保护碱基`CCC`（直接添加在序列末尾）。
### 最终设计的序列（72 bp）：
```
CCC CATATG aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac GAATTC CCC
```
- 大写部分：酶切位点（NdeI和EcoRI）及保护碱基。
- 小写部分：原始目标序列移除起始`atg`后的部分（60 bp）。
### 详细说明：
1. 5'端设计：
- 保护碱基：`CCC`
- NdeI位点：`CATATG`（其中`ATG`是起始密码子）。
- 目标序列调整：移除原有的`atg`，保留`aacctgattgattgctgcgaaatttgctgcaacccggcgtgctttggctgcctgaac`（60 bp）。整合后，起始密码子由NdeI提供，氨基酸序列不变（Met-Asn-Leu-Ile-Asp-Cys-Cys-Glu-Ile-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Phe-Gly-Cys-Leu-Asn）。
2. 3'端设计：
- 目标序列末尾直接添加EcoRI位点：`GAATTC`。
- 保护碱基：`CCC`（添加在EcoRI之后）。
### 设计后的完整序列：
```
CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAAATTTGCTGCAACCCGGCGTGCTTTGGCTGCCTGAACGAATTCGCC
```
- 序列长度：72 bp（包括保护碱基、酶切位点和目标序列）。
- 酶切验证：
- NdeI切割后：5'端产生 CCC + CATG 突出端。
- EcoRI切割后：3'端产生 AATT 突出端 + CCC。
### 在pET30a(+)中的克隆：
1. PCR扩增：使用以下引物扩增目标序列：
- 正向引物（5'-3'）：
CCCCATATGAACCTGATTGATTGCTGCGAA
（含NdeI位点，下划线部分为`CATATG`）
- 反向引物（5'-3'）：
GGGGAATTCGTTCAGGCAGCCAAAGCACGCC
（含EcoRI位点，下划线部分为`GAATTC`；序列为目标序列3'端的反向互补）。
2. 酶切与连接：
- 用NdeI和EcoRI双酶切PCR产物和pET30a(+)载体。
- 将切割后的片段与载体连接，目标序列插入MCS中，融合表达载体提供的His标签。
### 注意事项：
- 阅读框：NdeI位点的`ATG`确保起始密码子正确，EcoRI位点位于终止密码子之前，载体自带终止密码子（无需在目标序列中添加）。
- 保护碱基：`CCC`增强NdeI和EcoRI的酶切效率（依据NEB指南）。
- 验证：测序确认插入序列正确，避免移码或突变。
此设计确保目标序列高效克隆到pET30a(+)载体，适用于原核表达。