PCR引物与酶相关知识总结
atlas 2011-10-10农业
1.PCR引物的设计
(1)长度。过长的引物会使延伸温度超过耐热DNA聚合酶的最适温度,过短则会影响PCR的特异性。一般为18-25bp,一对引物差值应小于3bp。
(2)基本成分。G+C在40%-60%,四种碱基应随机分布,避免堆积,尤其是3’端引物,不应有连续的3个G/C互补,否则会使引物与核酸G/C密集区互补,影响PCR特异性。
(3)引物自身。不因出现反向互补序列。或者大于3bp的自身互补序列,否则会出现发夹结构。
(4)引物之间。应无互补序列,尤其是避免3’端的互不重叠,以免形成引物二聚体。(可使用Hot Start PCR / Touch Down PCR避免此问题)
(5)3’末端。引物3’末端是引发延伸的起点。因此一定要与模板准确配对,四种碱基有一定的错配规律,以引物3’末端的A影响最大。另3’末端错配时,不同碱基的引发率存在很大差异。当末位是A时,错赔率低,应避免引物3’末端的第一位是T,引物3’末端最佳碱基选择为G/C,配对较为稳定。
(6)5’末端。引物5’末端并无严格限制。在于模板结合的引物长度足够的前提下,5’末端可不与模板结合,引物5’末端可被修饰,如附加限制性酶酶切位点,引入突变位点,标记生物素等,其PCR产物既含有目的片段,两侧有具有附加片段。
(7)溶解温度。3’末端引物与5’末端引物应具有相似的Tm值,其差值应小于5℃,扩增产物与引物的Tm值差值应小于10℃,以确保扩增产物的有效变性。
(8)引物的特异性。引物与非特异性扩增序列的同源性不超过70%,或者连续的8个bp的碱基同源。
(9)引物的简并性。引物的3’末端应为保守氨基酸序列,即采用简并密码较少的氨基酸,如Met,Trp,且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于3’末端。


2.引物的用量与计算
在PCR体系中,引物的浓度一般为0.1-0.5mM,这一浓度足以使1kb的目的片段扩增30个循环。引物浓度过低则产量少,浓度高则促使引物二聚体的形成与非特异性产物的形成。
引物浓度的计算:
摩尔猝灭系数(Em)是在1cm光程的比色杯中测定1M的寡核苷酸在UV260nm的OD值.
Em=16000A+23000G+7000C+9600T
Eg:    一纯化的24bp寡核苷酸溶于100ul ddH2O中,取10ul定容1000ul,测定OD260nm=0.76,则原液OD值为0.76*100=76.
    若A=G=C=T=6,则Em=267600
    故原液中寡核苷酸浓度为:76/267600=340nM

3. Thermostable DNA Polymerase
Taq DNA Polymerase
由Thermus aqusatics YT-1分离得到,该酶基因2499bp, 编码分子94kDa,共823个氨基酸残基。
(1)热稳定性。Taq pol在92.5℃,95℃,97.5℃下半衰期分别为130min,40min与5min,若设设每循环热变性时间为30s-60s,则30轮循环的累积变性时间为15-30min,所以Taq pol仍可保持较高活性。
(2)高催化活性。Taq pol 可达200000U/mg,催化的最适温度为75-80℃,150-300个bp/(s*酶分子),70度约为60个bp/(s*酶分子),55度约为22个bp/(s*酶分子)。
(3)忠实性。Taq pol 与 E.coli pol I的N端区域(此区域与该酶具有5’-3’外切活性有关)高度同源,由于Taq pol无E.coli pol I的3’-5’外切酶活性区的同源序列。因此Taq pol不具有Klenow酶的校对功能。再起催化的PCR扩增过程中引起的碱基错配的几率大大增加了。通常,Taq pol在PCR反应中出现的碱基错配率为1/300~1/18000,经过25个循环后,扩怎产物的序列中,每400个就有一个与原始序列不同。
(4)反转录活性。当Mg2+在2~3mM,68℃时,Taq pol具有类似反转录酶的活性,若有Mn2+则更佳。若体系中没有Mn2+ 则可直接使用Taq pol进行150~250bp的反转录。
(5)非模板依赖的聚合活性。Taq pol有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的活性。可在新形成的双联产物的4’末端加上一个非模板依赖的碱基,在4中dNTP中,Taq pol对dNTP的聚合能力最高,在标准的PCR条件下,产物4’末端的非模板依赖碱基通常为A,利用这一特性我们能够构建d/T载体来克隆带有dA尾的产物。
    用Klenow酶可将3’端的非模板依赖的聚合碱基去掉。PCR程序结束后,加热到99℃ 10min灭活Taq pol,调整Mg2+至5~20mM,加入1~2U E.coli DNA pol I Klenow片段,室温反应5-10min。
来自 农业
 
2011-10-10 13:09:32
1楼
后天生物考试刚好复习一下
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2011-10-12 12:37:42
2011-10-12 12:37:42
atlas(作者)
2楼
其他Thermostable DNA Polymerase
(1)修饰Taq pol。如重组Taq pol(rTaq pol)与Stoffel片段。
    rTaq pol 是利用基因工程在E.coli中表达的Taq pol。具有更高的热稳定性,T97.5℃(1/2)=10min.
    Stoffel片段是除去了Taq pol N端的289个氨基酸残基得到的一种无5’-3’外切酶活性的61KDa的酶蛋白。T97.5℃(1/2)=20min,对于G/C丰富的模板以及具有二级结构的模板的克隆极其有利。
(2)Th DNA pol。由T.thermophilus分离得到,在Mn2+存在与高温情况下, 能够有效转录RNA。使cDNA的合成与扩增可以使用同一种酶催化。
(3)Vent DNA pol。T97.5℃(1/2)=130min。具有3’-5’外切酶活性。在催化DNA合成中具有校正功能,错配率1/31000。
(4)Pfu DNA pol。由Pyrococcus furisus分离得到,具有5’-3’和3’-5’的外切酶活性。具有更强的校正功能。T97.5℃(1/2)>3h。但在无dNTP情况下会降解模板。
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atlas(作者)
3楼
答问:
1.内切酶
    这是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶(DNase),它们的切点大多很严格,要求专一的核苷酸顺序内切酶—识别顺序。长期以来,难以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段来分析。
    第一类内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。
    第二类内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA 片段,并能构建来自不同基因组的DNA 片段,形成杂合DNA分子。因此,这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
    第二类内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。
    第三类内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA 片段,具有各种单链末端。
2.外切酶
    核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键,降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸(DNA为dNTP,RNA为NTP)。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。
3. Klenow片段
(克列诺片段,Klenow fragment或称克列诺酶,Klenow enzyme):E.coli DNA pol I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性,但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。
  它可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸,则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA 片段,要用被切成平头末端的DNA 片段连接时,可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头,然后在DNA连接酶作用下把两个DNA 片段连接起来。
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