【原创】PCR循环参数相关-总结
atlas 2011-10-12农业
PCR循环参数
1.变性。
    变性温度取决于模板G+C的含量与DNA pol的热稳定性。变形时间取决于模板的长度与DNA pol的热稳定性。通常的解链温度为95℃,30s。温度过高或时间过长会使DNA pol失活,dNTP损失。通常先使模板在97℃下变性7-10Min,再进入循环,当待扩增片段在100-300bp时,可采用二步PCR法,即95℃变性5-10个循环后,改用87-90℃以改善PCR产量。而环状DNA复性太快。通常先将其酶切线性化后再扩增,为了防止蒸发可在反应液上覆盖一层优质无菌液体石蜡。
2.退火。
    退火温度取决于引物的碱基组成,长度与浓度。一般较高的退火温度有利于提高PCR反应的特异性,但同时会降低其扩增效率。合适的退火温度应低于引物的Tm值5℃左右。(可使用DNAman、Oligo等软件进行设计)
    一般25bp以下的引物可遵照以下公式:
    Tm=4*(G+C)+2*(A+T)
3.延伸。
    延伸一般使用72℃(采用Taq pol),碱基的掺入率为35-100bp/s。时间有模板长度决定。当扩增片段小于150bp时可以省去延伸步骤,退火温度下的Taq pol 足以完成延伸。
4.循环次数。
    当待扩增片段的拷贝数分别为3*105、1.5*104、103、50时最是循环数一般为25-30、30-35、35-40、40-45次。一般最终拷贝数都能达到1012。
Nf=N0(1+Y)n  Nf为最终拷贝数,N0为初拷贝数,Y为扩增效率,n为循环次数。
5.其他影响因素。
    Hot Start PCR。在PCR第一次循环前,反应体系由较低的温度开始升高,由于Thermostable DNA Polymerase具有较为广泛的作用范围,故可以引发模板与引物的非特异性配对的短延伸(3’加的若干个碱基),从而导致非特异性扩增大增。
办法:(1)Thermostable DNA Polymerase抗体。抗体可以在低温下结合Thermostable DNA Polymerase使其无酶活性,当高温下Thermostable DNA Polymerase抗体失活,Thermostable DNA Polymerase开始作用。
    (2)用石蜡分割反应体系与酶。当加热时石蜡溶解,则酶与体系接触开始反应。

PCR反应的忠实性
1.模板核酸浓度。
当使用Taq pol时,错配率为10-4。若仅有10个拷贝时,扩增终产物将有10%的错配。当模板有105个拷贝时错配仅占1/105,故模板一般应在102-105个拷贝。
2.dNTP浓度。
    当dNTP浓度明显低于Km值时(dNTP<10um),会增大错配率。一般控制在每种10-50um。
3.Thermostable DNA Polymerase.
    为保证忠实性。应使用具有校正功能的Polymerase,如Pfu,T4 pol等。

平台效应。
在PCR后期扩增产物的增加将有指数型转为平坦曲线型。同时出现大量非特异性扩增,称平台效应。
因素:  1.dNTP, Primer的浓度不断降低。
        2.酶与模板的比率降低。
        3.酶活与dNTP的稳定性降低。
        4.非特异性扩增与引物二聚体与底物竞争。
        5.高浓度的底物,变性不完全。
        6.当产物>10-8时,会降低Taq pol的延伸能力。
        7.酶与PCR产物结合,酶分子减少。
来自 农业
 

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