【原创】基于rDNA-ITS序列的生物分类
atlas 2011-10-12农业
1. 核糖体rDNA的结构及其特点
核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒,执行着蛋白质合成的功能,它由几十种蛋白质和rDNA组成。编码rDNA的rDNA是基因组DNA中的中等重复、并有转录活性的基因家族(gene family)。rDNA一般由转录区和非转录区构成。核糖体DNA是核DNA基因组中度重复簇的一个组分,在真核生物基囚组中有100~500个拷贝,总长度为7~13 kb。核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成,其基因组序列从5’到3’依次为:转录区包括5S、5.8S、18S和28S rDNA,其中18S、5.8S和28S基因组成一个转录单元,产生一个前体RNA。内转录间隔区ITS(internal transcribed space)位于18S和5.8S rDNA之间(ITS1)以及5.8S和28S之间(ITS2),在18S rDNA基因上游和28S rDNA基因下游还有外转录间隔区ETS(external transcribed space)。ITS和ETS区的转录物均在rRNA成熟过程中被降解。ITS和ETS包含有rDNA前体加工的信息,在rRNA成熟过程中有着相当重要的作用。非转录区又称基因间隔区IGS(intergenic space),它将相邻的两个重复单位隔开,在转录时有启动和识别作用。整个rDNA基因簇从5’到3’端依次为基因间隔区IGS(包括在18S rDNA基因上游的ETS1和在28S rDNA基因下游的ETS2);位置可变的5S rDNA基因;18S rDNA基因;ITS1序列;5.8S rDNA基因;ITS2序列,以及28S rDNA基因。

2.ITS序列在真菌分子系统学研究中的应用
真菌属于真核生物,其ITS区域包含两个不同的非编码区域。一个基因组内有60~200个拷贝。真菌ITS区域长度一般在650—750bp。18S、5.8S、28S rDNA基因序列进化缓慢而相对保守,但这三个基因序列之间的ITS序列的进化则相当迅速,因而rDNA序列广泛用于真菌各级水平的系统学研究。18S rDNA与28S rDNA分别约为1.8kb和3.4kb,序列中既有可变区又有保守区在进化速率上比较保守,其中18S比28S基因更加保守,是在系统发育中种级以上阶元的良好标记。5.8S基因分子量小且高度保守,较少用于系统学研究。但它为真菌rDNA PCR扩增的通用引物的设计提供了极大的方便。
由于ITS区不加入成熟核糖体,所以受到的选择压力较小,进化速率较快,在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中,从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度为1000bp到小于300bp人们可以从不太长的序列中获得足够的信息,可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究。
来自 农业
 
2011-10-12 12:43:14
atlas(作者)
1楼
114928


3. rDNA-ITS序列的扩增。
典型程序
A    PCR反应体系:
10×Taq buffer                            5.0 μL
25 mmol/L MgCl2                    4.0 μL
10 mmol/L dNTP                      1.2 μL
10 μmol/L ITS1                            2.0 μL
10 μmol/L ITS4                              2.0 μL
5 U/μl Tag DNA polymerase    0.25 μL
100-200 ng/μL DNA                    2.0 μL
ddH2O                                            Up to 50 μL

B    PCR扩增反应程序:
94℃预变性         4 min

{94℃变性           30 sec
51℃退火           30 sec
72℃延伸           70 sec }
共35个循环
72℃延伸           7 min
4℃保存             ∞

4.rDNA-ITS测序与分析将扩增出来的目的核酸片段送上海生工等公司纯化后进行测序。将测得的序列提交美国NCBI的GENBANK获取对比指标靠前的20个相似序列,通过BLAST工具和DNAMAN软件进行比对分析并以Neighbor-Joining方法构建系统发育树。
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2011-10-22 20:53:56
2011-10-22 20:53:56
2楼
前段时间做实验,用原核的,8f,1492r。
扩出来的条带不如想象的浓,也可能模板的问题吧。
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