微生物實驗基本技巧(一)
HOHOLO 2009-4-3农业
看見有朋友對微生物實驗有興趣, 後生因為在工作上的關係,有些淺薄的經驗可以分享一下,不過才疏學淺, 錯漏百出, 而且恐有中英傳譯之誤, 望各前輩多多指正,感激萬分!  以下一切資料除個別引用外,皆為筆者跟據所學,及工作上的經驗,2者融會的分享,如需要正規指引,請參照以下書目:

"AOAC INTERNATIONAL (OMA),Official Methods of Analysis "


這次先分享最最最基本的技巧, Aseptic technique (無菌操作)

微生物實驗上, 所謂--無菌--; 其實是指除了操作者需要培植的微生物外, 不容許有機會讓其他微生物污染培養基,營養液,稀釋用水什至是所有用具,空氣,工作桌及自己! 大前提是假設所有未消毒的--東西--都已被微生物污染(儘管已經完成一般清潔). 無菌操作一直廣泛地應用於一切需要微生物安全的實驗和操作, 除微生物學實驗,化驗的工作外, 醫院外科手術,接生,中醫針炙等醫療程序也會應用到無菌操作.沒有採取無菌操作的微生物學實驗,結論是公認100%不可信的.


跟據外國維基百科上的定義:
Aseptic technique is the name given to the procedures used by microbiologists to prevent microbial contamination of themselves, which may result in infection, contamination of the environment they are working in (e.g. fomites), and contamination of the specimen they are working on, which is especially important when a pure culture is desired. It is used whenever specimens are to be transferred between media, for example, when subculturing.
中文:
無菌操作是指微生物學家用來防止:
1. 微生物污染自己(可能會因此而做成感染),
2. 污染你工作的環境
3. 污染你工作的樣本. 尢其是在進行純種培植時
4. 在移植及接種過程中引致額外污染


操作上常用的殺菌方法如下:
1. 火焰:本生燈,酒精燈等,用來消毒小工具,器皿開口及工作範圍的空氣等
2. 高壓爐: 一個用超高溫水蒸氣來殺死一切微生物的工具,包括最難對付的真菌枹子或是細菌的內枹子
3. 酒精,消毒液消毒皂: 消毒小工具,雙手,桌面等
4. 紫外光燈: 消毒透明用具好像是塑膠培養皿,樣本袋等

現實上,我們會用以下的常用方法來消滅或避免不想要的微生物污染:

1. 工作時穿上整潔的白袍,有需要時帶上消毒手套(不是普通的外科手套,消毒手套是密封在已消毒的包裝中)及口罩

2. 開始工作前,每項工作後以及離開前, 都應先把自己雙手及桌面消毒, 雙手可以用殺菌皂液及水洗, 也可以和桌面一樣用75%酒精噴灑~ 雙手在噴曬後可以讓它自然揮發, 桌面就需要用乾淨的紙巾刷乾.

3. 需要與樣本直接接觸的所有用具,比如:燒杯,樽子,玻璃移液管等(鑷子,接種用的鉑絲和小剪刀除外),以及準備好的培養基,營養液,稀釋用水,需用高壓消毒鍋,在121攝氏度的水蒸汽中消毒15-30分鐘(視乎需要,一般是用15分鐘,用完的菌種,廢物等就需要1小時-2小時)

4. 樣本需要用已用高壓鍋消毒的有蓋樽子,有蓋試管或是在出廠前已預先消毒的樣品塑料袋或者均質機用袋密封好, 純菌種在製備時也需要用無菌操作.

5. 用完即棄的用具,例如塑膠培養皿,塑膠移液管等,買回來時已經預先消好毒的了, 未用之前不要打開包裝,打開之後需盡快用完,未用完的把開口對摺2次之後用膠貼封好

6. 正式開始工作之前先再用75%酒精清潔雙手和桌面,揮發完之後就可以點燃酒精爐或者本生燈,形成一個ASEPTIC ZONE(無菌圈), 火焰熱力所到之處(距離火焰方圓20cm3的地方)的空氣都已經被火焰消毒了~所有需要無菌操作的實驗步驟都要在這範圍裡進行.

7. 實驗中需要用到接種用的鉑絲時,用前需要用火焰把鉑絲先加熱到紅熱, 之後在無菌圈中慢慢冷卻數秒,再沾上菌群落,或者純菌種營養液中, 再移種到已消毒好(第3點)的培養基,營養液或稀釋用水中.之後鉑絲要再次燒至紅熱,冷卻後放回原位,下次再用時重複步驟

8. 除打開培養皿外, 打開其他有蓋器皿前,無論內容物有菌與否,也需要先用火焰微微灼燒器皿的開口(把試管,樽子等在火焰正上方打開蓋子,把管口水平地在火焰上快速地略過一下), 用完蓋回蓋子之前也要先灼一下

9. 每次打開蓋子除了必須進行"8."之外,需盡快蓋回蓋子,並保持在無菌圈來進行

10.剪刀和鑷子在用前先用75%酒精泡著,用時提起把多餘酒精滴在酒精容器內,之後在火焰上把最後的酒精燒掉,但不能燒紅~

11. 用完的器具,比如說移液管, 用完掉棄在消毒液中泡著, 完成工作後收集,用高壓爐消毒後掉棄或是洗淨循環再用

12. 所有已消毒的用品或藥劑一旦掉到地上,或是與操作者的手,身體;桌面有直接接觸,或是懷疑已被污染,必須再次清潔之後無菌消毒,才可以再用.

13. 一切有被微生物污染危險的物品,在未被殺菌消毒前,不得帶離實驗室.

14. 用完的樣本,純菌種,如沒有儲存的必要,當作含菌廢物處理(高壓爐消毒才掉棄)

總括來說..是一大堆嚴密的步驟,來把所有有機會的污染減少或是避免..在家中要實行起來不容易(微生物學實驗從不應該在家中做)..喜歡看圖的朋友們..對不起了~要下星期3才可以拍,到時後補給大家!

好久沒有發這麼長的貼了~錯字百出!大家見諒!
+3000  科创币    虎哥   2009-04-03    很好
来自 农业
 
2009-4-3 14:24:40
1楼
基本上能理解了...家庭条件根本没法去做..那建筑本身就要求很高了 [s:182]
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
HOHOLO(作者)
2楼
是的~光光是一部高壓消毒爐已經是5位數字的東西了~
我們研究過~或許進口的煮食用壓力鍋可以代替高壓消毒爐用~
別的東西都不難,也不是太貴~只是在家做..最大問題是安全~
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
3楼
去过国内某class3的生物实验室的路过 - -
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
4楼
传说中的C3实验室? [s:94]
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2009-5-6 03:03:03
2009-5-6 03:03:03
5楼
引用第2楼HOHOLO于2009-04-03 14:31发表的  :
是的~光光是一部高壓消毒爐已經是5位數字的東西了~
我們研究過~或許進口的煮食用壓力鍋可以代替高壓消毒爐用~
別的東西都不難,也不是太貴~只是在家做..最大問題是安全~


国产的小型专业灭菌用压力锅,没有那么贵啦。

http://item.taobao.com/auction/item_detail-0db2-281864b4b4df95ad2a54bf9a8b9d7358.htm


厨房用的煮食用压力锅恐怕难以达到表压0.12MPa/121℃
的消毒标准。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
6楼
浏览这段内容需要12学术分
内容已隐藏
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
7楼
ls直接说嘛,搞得我们这些穷人看不到

家里做实验是可以的,只要注意不要培养危险细菌就可以了。
我培养微生物时,虽然不知道这些规矩,不过我倒是都用酒精清理干净了,什么东西只要可能有微生物,统统酒精喷雾伺候。
消毒用普通高压锅是可以的,不过时间要长一些,110度30min就有121度10min的效果
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2009-5-7 10:07:38
8楼
适当浓度的化学药剂(酒精、甲醛、苯酚、煤皂酚等)溶液进行喷雾,不是万能的,可能的副作用是残留药剂污染培养基,导致目的培养生物体受到抑制甚至导致突变发生。

高压蒸汽、235.7nmUV灯、O3消毒,无有害物质残留,是其优点。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
HOHOLO(作者)
9楼
引用第5楼hamdad于2009-05-06 03:03发表的  :


国产的小型专业灭菌用压力锅,没有那么贵啦。

http://item.taobao.com/auction/item_detail-0db2-281864b4b4df95ad2a54bf9a8b9d7358.htm
.......


你說的這種高壓鍋我在隔離的生物科技實驗室見過~
如果用在微生物的小量培植,應該也可以~
不過如果量大,或者是化驗工作~量大,這小東西的效率就不足了~
而且這種上方開口式,手動栓緊的密封方式, 新手使用很易發生危險~
咱們用的高壓爐,最貴的部分是自鎖系統~在壓力未降至常壓或者溫度高於80C 時, 蓋子會自動鎖死~以保安全~

廚房用的高壓鍋嗎~應該可以的~
高壓蒸汽消毒除了用於微生物消毒,常用於另一種大家常用的東西~
罐頭食品! 所有罐頭食品都必會被高壓蒸汽才出廠, 消毒參數跟微生物用的十分相似,也是121C, 只是時間比較長,舉個例,肉食罐頭多數要長達1小時的消毒, 這個製造我上一年才食品保存學科時親手做過~
除了用工業爐, 我們那個時候也試了用煮食用的高壓鍋~不過需要1.5小時~
所以理論上用那些煮食用的高壓鍋消毒也是可行的~
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
HOHOLO(作者)
10楼
給大家一些更新資料~
上星期五我的研究實務工作接近尾聲,於是花了些時間來調查一下無菌圈(1樓第6.) 中的空氣質素~
用的是預先準備好的無菌SPCA培養基, (SPCA: Standard Plate Count Agar)
跟據標準操作,用75%酒精清潔桌面,之後點燃本生燈(無色焰)
之後把2隻SPCA 培養基的蓋子打開,在本生燈直徑20CM 內曝露了15分鐘~
37C 48小時培植後, 可見菌群落分別為12CFU(可理解為"粒")和10CFU~

我把這結果告訴了的以前在食品廠做化驗員時的同事,剛巧她們近期也做了這個測試,結果是0CFU ,
與老師討論後,結論為, 微生物學實驗室的空氣"龍蛇混雜",這個水平是可接受的~加上工作人員四處走動,帶動未被消毒的氣流進入無菌圈中, 才會有這樣的結果~

我的結論是: 1. 不要在家中搞微生物實驗, 要不是你家中的空氣質素.....................
                      2.  我們嚴格做足了無菌操作, 都仍有污染樣品的可能, 如果沒有做無菌操作的話~那些玩玩兒是一點意思都沒有的~
                      3. 各前輩同業, 實驗室考慮增添空氣清新機..勤清潔空調隔塵網,有助增加實驗準確性;未必要人員也需禁止在實驗室中四處走動
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
11楼
大约从1987年开始,老妈开始每年夏季DIY番茄罐头,每年大约制作20~30kg(净含量),就是用普通的民用高压锅,常压蒸汽(不安装密封圈,不放安全锤)消毒30分钟后,立刻密封。

180天保存完好率超过95%。

罐头容器,最初使用500ml医用盐水瓶子,橡胶塞,胶布密封针眼,后来采用现成的商品玻璃罐头瓶子,铁皮盖,消毒后直接拧死。

每年冬天家里都可以保证西红柿鸡蛋汤的原料供应,不需要去买价高味道差的温室番茄。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
12楼
那种小型的手拧元宝螺母启/闭的专业消毒用高压锅,经过朋友在海拔5000m+的科考中实践,能够达到的极限温度(压力)还是比普通的厨房用压力锅强一些的,煮菜用因为温度有保证,风味好一些。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
HOHOLO(作者)
13楼
引用第11楼正版hambaby于2009-05-07 12:52发表的  :
大约从1987年开始,老妈开始每年夏季DIY番茄罐头,每年大约制作20~30kg(净含量),就是用普通的民用高压锅,常压蒸汽(不安装密封圈,不放安全锤)消毒30分钟后,立刻密封。

180天保存完好率超过95%。

罐头容器,最初使用500ml医用盐水瓶子,橡胶塞,胶布密封针眼,后来采用现成的商品瓶子,,消毒后直接拧死。
.......


沒錯,我們當日也就是用铁皮盖+玻璃罐头, 絕對可行~
不過罐头食品再細分2大類,LOW ACID FOOD, HIGH ACID FOOD,
中文不太清楚, 大致上是低酸度和高酸度食物~
而罐头食品消毒跟據時間長短分為12個D~(你看我的地址就會明白)
1個D 等於需要在121度殺死90%微生物的時間(也就是殺1個log)
12個D 之後,基本上是全死掉了~

LOW ACID FOOD就是所有食品除了水果和番茄~ 多數都需要用盡12D 確保完全消毒~
HIGH ACID FOOD嗎, 就是高酸度的水果和番茄, 因為肉毒菌屬的都不喜歡,什至是難以活在PH<4.5 的環境, 所以這類食品不需要12D 消毒,1D-3D 也就可以了~當然,也因為這類食品的質料太軟,煮太久會溶掉,不實際~

所以HAMBABY 母親的做法十分正確~可是肉類不多消毒一會的話~放久了就會中肉毒毒素了~(這個死得很慘~)
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2009-5-8 01:42:08
14楼
引用第5楼hamdad于2009-05-06 03:03发表的  :
厨房用的煮食用压力锅恐怕难以达到表压0.12MPa/121℃
的消毒标准。

多炖一会
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
15楼
紫外线杀菌不错,如果光强足够,什么都活不下来
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2009-5-15 11:07:59
2009-5-15 11:07:59
16楼
确实,在家时不能做的。没有条件
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2009-5-31 00:14:26
2009-5-31 00:14:26
17楼
家中最大的阻碍应该是在空气无菌的部分
如过在新制的二氧化碳中完成操作(假设我有足够大的玻璃容器)
然后再在里面加入新制的氧气进行培养
不知道这样可行不可行?
这样就把无菌的门槛降到了容器无菌上,而容器无菌用酒精或者紫外线灯就可以办到了吧?
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
18楼
LS
目前来说,实验室的空气无菌处理是这样的

接种需要在酒精灯火焰附近完成,接种环提取菌种之后菌种容器口需要在火焰旁快速晃三次

详见高中生物选修1
(生物技术实践)
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2009-6-4 21:22:03
2009-6-4 21:22:03
19楼
LS你不觉得很需要技巧而且麻烦……
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2009-6-5 12:07:20
20楼
现代微生物实验,广泛使用超净工作台作为无菌、无尘局部操作平台
价格根据档次不同,从1K~10K+RMB的都有

类似这个
http://item.taobao.com/auction/item_detail-0db1-2ec7c75f3c08d2feadc1529a6e59cb35.jhtml?cm_cat=0

技术参数
洁净等级:l00级≥0.5μm(美联邦209E)
平均风速:0.25~0.45m/s(可调)
噪音:≤62dB(A)
振动/半峰值:≤0.5  μm(x.y.z方向)
照度:≥300Lx
电源及功率:AC单相220V/50Hz <200W
工作区尺寸:500×400×450mm
外形尺寸重量:650×550×650mm
灯规格及数量:10W×①/10W×①


产品介绍
产品用途
此工作台是一种通用性较强的局部净化设备,它应用广泛,食用于电子、国防、精密仪器、仪表、制药等行业。

主要特点
1.水平流行,准闭合式玻璃风门,操作方便。
2.小巧,可随意放置于一般工作台上操作,便于小型工作室使用。
3.采用遥控开关快慢双速控制风机系统,保证工作区风速始终处于理想状态。

18楼所描述的技术,是土法炼钢的年代广泛采用的,有效,但是无法完全可靠避免杂菌污染。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论

想参与大家的讨论?现在就 登录 或者 注册

插入资源
全部
图片
视频
音频
附件
全部
未使用
已使用
正在上传
空空如也~
上传中..{{f.progress}}%
处理中..
上传失败,点击重试
{{f.name}}
空空如也~
(视频){{r.oname}}
{{selectedResourcesId.indexOf(r.rid) + 1}}
ID:{{user.uid}}
{{user.username}}
{{user.info.certsName}}
{{user.description}}
{{format("YYYY/MM/DD", user.toc)}}注册,{{fromNow(user.tlv)}}活动
{{submitted?"":"投诉"}}
请选择违规类型:
{{reason.description}}
支持的图片格式:jpg, jpeg, png