【原创】制造转GFP荧光蛋白基因的大肠杆菌
atlas 2012-6-8农业
先来两张效果图
这是使用了凝胶成像系统的紫外,比上次发帖时的绿色荧光效果强很多。
136415

136416
  
+1  学术分    虎哥   2012-06-09   W发的都是精品
+10  科创币    nazi_卡宾   2012-06-09   厉害,这帖比较详细,这次看懂了许多。继续努力哦。
+200  科创币    wesker   2012-06-09   终于 很好
+50  科创币    zhaokenb   2012-06-09   大赞!
+1  科创币    elvaw80   2012-06-10   详细,精品!
+50  科创币    带火星的木条   2012-06-18   这些东西只在生物课本上看过. 大赞
+10  科创币    ds4442001   2012-06-27   不懂生物,羡慕
+10  科创币    wzh19940105   2012-06-27   越看越漂亮
来自 农业
 
2012-6-8 23:03:35
atlas(作者)
1楼
首先要制备大肠杆菌的感受态细胞,以便于接收外源基因。
所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞,使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。通常用0.1M CaCl2处理细胞,就可得到感受态细胞。细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。将重组DNA导入细胞的方法有多种,入热休克法,电击法等。通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛,导致外源 DNA进入细胞。本实验中使用了热击法转化。

材料
    LB液体培养基培养E.coli TG1至OD600约为0.4.
    0.1M CaCl2(含10%甘油)
    氨苄青霉素(100mg/mL)
    阿拉伯糖
    LB固体培养基
仪器
    冷冻离心机
    无菌操作台
    微量移液器
    水浴锅
    
方法
感受态的制备与转化
①取菌液1.5mL,8000rpm×1min离心,弃上清(尽量除尽,下同)。
②加入600μL预冷的0.1M CaCl2溶液,悬浮沉淀,4℃离心4000rpm×1min,弃上清。
③加入400μL预冷的0.1M CaCl2溶液,4℃离心4000rpm×1min,弃上清。
④加入200μL预冷的0.1M CaCl2溶液,冰浴20min,4℃离心4000rpm×1min,弃上清。
⑤加入100μL预冷的0.1M CaCl2溶液,4℃冰箱放置。
至此制成感受态。

摇床上培养到OD600=0.48的E.coli TG1
136417

超净台准备
136418

离心
136419

涡旋震荡。只有第一次加氯化钙时可以, 后期不行,因为感受态细胞结构不完整,极易因为震荡操作裂解。
136420

丢入冰箱备用
  136421



接下来就是外源基因的转化。
我使用的含有GFP基因的质粒,是实验前人构建的。图谱没有找到,十分遗憾,知道的只有含有氨苄抗性,阿拉伯糖操纵子下连接GFP基因。
质粒溶液含DNA 4400ng/μL,本次实验使用1μg进行转化,故取用0.227μL质粒溶液。
取制备好的感受态细胞,分别向其中加入质粒,冰浴10min,42℃热激90s,冰浴3min,加入800μL LB液体培养基,37℃复苏20min,取100μL涂布于GFP平板上,37℃倒置培养20h。
设置对照
转化        空LB    Amp    Ala    Amp+Ala      
未转化     空LB    Amp    Ala    Amp+Ala

结果

转化                  空LB            Amp         Ala                Amp+Ala  
菌落数            无法计数         11         无法计数              12

未转化               空LB            Amp        Ala                 Amp+Ala
菌落数            无法计数          0         无法计数               0  

转化组
Amp
136422

Amp+Ala
136423

紫外下
  Amp
136424

可以看到少许荧光,但是不如下面的。说明GFP在无阿拉伯糖诱导下,仍有一些本底表达。
Amp+ala
136425


未转化组
Amp 无菌落
   136427

Amp+ala 无菌落
136426



本实验转化率=12 cfu/μg DNA
+20  科创币    北落师门   2012-06-08   离心机和咱的一样~
+1  科创币    飞线大师   2012-10-21   问一下质粒怎么制造……我想试试
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2楼
玩泥煤的表示不明觉厉啊~~~
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
3楼
回 2楼(darkorochi) 的帖子
您的回复让人不明其意
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-9 10:07:44
4楼
回 3楼(atlas) 的帖子
想培养那种自己会发光的单细胞生物....
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
5楼
Re:回 2楼(darkorochi) 的帖子
引用第3楼atlas于2012-06-08 23:31发表的 回 2楼(darkorochi) 的帖子 :
您的回复让人不明其意


额 我说的太含蓄了吧。。。。
我学煤化工的,有一种煤叫 泥煤。。。。按转化形式是褐煤 无烟煤等的前身,每天分析实验就玩这些货。。。。
基本把生物忘了,虽然我gf学医上学期还在学微生物学,给我传授了点。
不明觉厉 = 虽然“不明”白是什么意思,但是“觉”得很“厉”害的样子、、、、
好久都没在kc看到化学的实验了,生物的更是凤毛麟角啊。。。。
(=,=)
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-18 04:14:35
2012-6-18 04:14:35
6楼
看来大肠杆菌很耐紫外线嘛

不太理解这些外源基因如何能够在细菌中复制的,而不是仅仅在人工导入的细菌中表达,希望楼主科普一下。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
7楼
回 6楼(虎哥) 的帖子
E.coli导入的是绿色荧光蛋白。它只能在紫外下发出绿光。所以采用紫外照的,但是不能长时间照。。。
转化的质粒上有氨苄青霉素抗性基因,由于培养基氨苄的存在,使得质粒得以保持存在。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
8楼
这些东西只在生物课本上看过. 大赞
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-19 01:05:38
9楼
离心机一样+1..............据说报价7W多...........
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
10楼
楼主知道Foldit蛋白折叠游戏么?
1.为什么折叠一个构型没有红色警告的分数有可能低于有红色警告的构型?
2.分数高的蛋白构型一定就能合成出来么?
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
11楼
现在的转基因食品已经够坑爹的了,楼主还搞这个,当心进入你自己的身体,总觉得有点可怕!
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
12楼
回 10楼(justkaka) 的帖子
这个只是随便玩过几下。我记得其中的几种红色警告,一是侧链过于紧密,二是有结构空洞(可能与功能域有关)。
如果你将其拉成一个长线状,那么这两种情况自然不会出现。但是却缺失了大量的三维结构域,当然分数要比有警告时低。

至于分数高的构象能否合成,我不敢回答。
137512

137513
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
13楼
回 11楼(jinggx) 的帖子
可以肯定的是我国当前所有的棉花都是转苏云金芽孢杆菌毒蛋白的。大部分的大豆是转基因的,不过提取脂肪酸的步骤不会涉及DNA,RNA的。大部分的番茄是转基因的,以提高保质期,貌似三腔的都是转基因的。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
14楼
谢谢解答。在问一个问题,细胞分裂完成后细胞核合成蛋白质的时间序列,有资料记载么?
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
15楼
回 14楼(justkaka) 的帖子
这个简单在这里回答说不清楚,你可以参看翟中和第四版的《细胞生物学》,有详细的机制介绍
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-20 22:19:31
2012-6-20 22:19:31
16楼
。。正在高考一轮复习中。好熟悉啊。。前两天才复习过。。
看着好亲切。。见到真的了。。呵呵
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-24 17:15:07
2012-6-24 17:15:07
17楼
回 7楼(atlas) 的帖子
哇塞,我前不久尚且在高中时的生物选修三--现代生物科技专题还在学这个的皮毛。Ecoil,氨苄青霉素抗性基因,好熟悉啊。
向生物学家致敬!
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
18楼
回 17楼(傻小子) 的帖子
其实对于职业进行分子生物学工作的人。这个实验的内容只不过是皮毛中的皮毛。。。
现在的分子生物学的发展简直是快的难以想象。。。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-25 00:08:33
19楼
回 13楼(atlas) 的帖子
我在超市买吃的,是要看标签是不是转基因的,如果是坚决不买。不过好似转基因水稻也允许了,兲唉朝,唉不让人活了,饭也没放心的了。
目胶存在很大争议的问题:1,转基因吃了有没有问题,没见过报导吃了死人的,不过动物实验已经表明这些东西不能吃,会导致消化道异常反应,胃、肝、脾有变异,尤其对生殖系统影响比较大。
2,转基因作物对生态的影响,极为明显,目前已经到验证。
3,吃了转基因食品,会不会把人的基因也转了,这个很难说,转基因的基因碎片又不像生物本来的基因那样包在细胞核内,这碎片很容易掉出来,这样就什么可能都有啊,虽说人的细胞核也算是稳定,但是消化道里有很多共生细菌,比如这个大肠杆菌,这些原核微生物被转基因可是很容易,然后它们在长期在你的身体里,很难说了!
相信一点,人从自然进化而来,那么大自然的食物可以吃,自然界不存在东西,吃了一定不行!比如氢化油,能吃的,不会死人,但是其问题这些都出来了吧,农药,以前虫害成灾,农药的出现号称救了多少人啊,这现在呢,这些问题也出来了吧,再过几十年,看转基因也必然是此结果。
楼主是专业的,可以分析一下这些问题吧。
有一个视频《转基因的前世与今生》大家可以搜一下看看。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
20楼
关于转基因,曾经设想用转基因食品,来延长人体端粒酶。但是分子生物学老师明确的解释是,转基因食物在消化道内会被彻底分解为短肽链或者氨基酸,被吸收之后没有任何作用。。。。。

所以某种意义上来说我从来没怕过转基因食物,但现在看来是不是当时被误导了?
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
21楼
这些年不仅自己原来的电子专业荒废了,第二专业的内容也已经荒废的不成样子了
高中时还野心勃勃的想要搞个超级人体细胞的实验(在各种病毒混合的环境下培养人体细胞,直到出现某种变异细胞能够在该环境下存活的超级细胞)。。。后来才知道当时确实很无知
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
22楼
回 20楼(bunny9915) 的帖子
前段时间,看到一篇天津大学的文章。内容是检测人体内的植物源小RNA,结果发现,人类体内中已含有了大量的与水稻micro RNA同源的DNA 片段。
并不仅仅是转基因的才会导致人类什么问题,正常的饮食摄取的肉,植物,同样会。这是人类与植物共同进化与适应的过程。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
23楼
LS提到的文章。
Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1 evidence of cross-kingdom regulation by microRNA

Abstract
    Our previous studies have demonstrated that stable microRNAs (miRNAs) in mammalian serum and plasma are actively secreted from tissues and cells and can serve as a novel class of biomarkers for diseases, and act as signaling molecules in intercellular communication. Here, we report the surprising finding that exogenous plant miRNAs are present in the sera and tissues of various animals and that these exogenous plant miRNAs are primarily acquired orally, through food intake. MIR168a is abundant in rice and is one of the most highly enriched exogenous plant miRNAs in the sera of Chinese subjects. Functional studies in vitro and in vivo demonstrated that MIR168a could bind to the human/mouse low-density lipoprotein receptor adapter protein 1 (LDLRAP1) mRNA, inhibit LDLRAP1 expression in liver, and consequently decrease LDL removal from mouse plasma. These findings demonstrate that exogenous plant miRNAs in food can regulate the expression of target genes in mammals.
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-26 00:04:04
24楼
回 22楼(atlas) 的帖子
十分正确,如果人体能获得转基因食物的外源基因,一样可以获得普通食物的基因
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
25楼
回 23楼(atlas) 的帖子
从食物摄取基因片段是事实,这样的话最极端的表现是不是Bt毒蛋白的基因片段被人体吸收,然后表达出来....
还有转基因食物主要的一些人工添加的基因都是提高产量和抗虫抗病的,有没有可能利用这种方式把部分能够提高人体免疫能力的基因也合成进去。
甚至可以将一些可能导致人体缺陷的基因修正。

还有就是LZ 搞生物分子学的,有没有一些关于现在电子生物领域的最新动态。很久没有关注这方面的信息了。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-27 12:26:47
2012-6-27 12:26:47
26楼
很好,以后大家拉屎都是发光的了
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-6-28 22:44:05
2012-6-28 22:44:05
27楼
1.0.1M CaCl2(含10%甘油),这个方法应该没有听说过,出处是哪里?我平时见的都是不含甘油。
2.你的操作可能有问题,就算是氯化钙法,也不应该这么低。估计至少也能达到10的3次方吧。(仅仅是估计,,没有测过,查的资料是10的5次方左右),我以前做的感受态,可以达到10的7次方。刚才看了一个资料,电转化的,号称10的10次方,真变态。

3.不错,图文并茂。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-7-3 13:24:45
2012-7-3 13:24:45
28楼
目测平板划线法?
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-7-5 12:09:36
2012-7-5 12:09:36
29楼
回 1楼(atlas) 的帖子
质粒 来张图
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
30楼
lz能让荧光基因受控就好了,给这个细菌点刺激就亮,没刺激就不亮。[s:274]
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
atlas(作者)
31楼
回 30楼(alloyjs) 的帖子
荧光就是受控的。GFP基因是在阿拉伯糖操纵子下的。没有阿拉伯糖,GFP基因仅能维持较低的本底表达。几乎可以说没荧光。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论
2012-7-7 19:09:04
2012-7-7 19:09:04
32楼
戴一次性手套的手放在紫外灯下,感觉不安全,最好包个报纸啥的,更保险。
折叠评论
加载评论中,请稍候...
折叠评论

想参与大家的讨论?现在就 登录 或者 注册

插入资源
全部
图片
视频
音频
附件
全部
未使用
已使用
正在上传
空空如也~
上传中..{{f.progress}}%
处理中..
上传失败,点击重试
{{f.name}}
空空如也~
(视频){{r.oname}}
{{selectedResourcesId.indexOf(r.rid) + 1}}
ID:{{user.uid}}
{{user.username}}
{{user.info.certsName}}
{{user.description}}
{{format("YYYY/MM/DD", user.toc)}}注册,{{fromNow(user.tlv)}}活动
{{submitted?"":"投诉"}}
请选择违规类型:
{{reason.description}}
支持的图片格式:jpg, jpeg, png