CTAB & 液氮研磨法提取基因组DNA及其检测与ITS序列扩增
atlas 2011-10-2农业
CTAB & 液氮研磨法提取Phanerochaete chrysosporium真菌基因组DNA
提取步骤:
①打开水浴锅65℃,预热CTAB提取液。
②液氮研磨样本,分装入离心管,每管约60mg。
③每管加入700ul CTAB提取液,涡旋混合后,65℃水浴保温1h,每10min摇匀。后取出冰浴5min。
④加700ul酚氯醇(25:24:1),轻颠倒混匀30min。离心机设4℃, 12000rpm。
⑤离心10min。
⑥取上清600ul,加入氯醇(24:1)600 ul,轻颠倒混匀20min。
⑦离心10min。
⑧取上清550ul,加入氯醇(24:1)550 ul,轻颠倒混匀20min。
⑨离心10min。
⑩加入55ul(1/10体积)的3M NaAc(4℃)与330ul(6/10体积)的异丙醇(-20℃),颠倒混匀,-20℃沉纯过夜。

图:
液氮研磨:
IMG_1154.jpg
IMG_1157.jpg
IMG_1170.jpg
分装样本后 ,加入预热的CTAB提取剂
IMG_1194.jpg
  水浴保温:
IMG_1195.jpg
冰浴5min
IMG_1203.jpg
1h后加入酚、氯仿、异戊醇试剂:
IMG_1196.jpg
高速离心机。eppendorf品牌。值得信赖。
IMG_1057.jpg
氯仿、异戊醇试剂处理
IMG_1206.jpg
醇析出DNA后。在超净台强风干燥
IMG_1186.jpg
+1  学术分    虎哥   2011-10-02   希望了解实验的目的、意义
+20  科创币    wesker   2011-10-02   
来自:农林牧渔 / 农业
 
atlas 作者
10年3个月前
1楼
制备1%琼脂糖凝胶。电泳30min后。浸泡于EB。1h后取出。紫外呈像系统检测
IMG_1193.jpg
图中显示:Marker最后的条带为10kb,基因组DNA为约12kb,符合常规
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
atlas作者
10年3个月前
2楼
IMG_1176.jpg
使用Nanodrop检测
该样本DNA浓度为894ng/ul。OD260/280=2.12,OD260/230=2.07
未做纯化,混有RNA残留故 OD260/280值偏高。
做its序列的扩增并不需要高纯度。故不作纯化。

使用TaKaRa的Taq试剂盒
IMG_1199.jpg
PCR程序
   搜狗截图_2011-10-02_21-27-18.png
PCR开始了
IMG_1208.jpg
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
wesker
10年3个月前
3楼
锡箔用来干啥?
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
虎哥
10年3个月前
4楼
赞扬,大爱。。
想请楼主普及一下人民群众喜闻乐见的几个东西:
DNA亲子鉴定的原理、过程、方法;
DNA测序的方法和流程。
如果能用实验做一小段来说明,配合完整的综述就更好了。
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
atlas作者
10年3个月前
5楼
测序一般都是交给公司去测序的。
测序已有测序仪可以使用了。化学测序十分繁琐。很难一时半会儿讲的清楚。

本实验的目的是提取基因组DNA,并扩增ITS序列的实验操作练习。使用的是已知明确分类的Phanerochaete chrysosporium。
ITS序列是一段在种间具有广泛变异的序列,而两端的rDNA 片段相对保守。故利用rDNA 的保守片段,设计引物its1,its4可以克隆出its全部片段。比对NCBI的数据库,即可得到较为准确的分类学信息。是微生物研究的的必要之举。当然并不能完全依靠分子鉴定。还要结合电镜下的结构学分类信息来综合考量
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
atlas作者
10年3个月前
6楼
锡纸包裹研钵,放在干热灭菌锅中,180度8小时。灭菌,除去所有RNase A 等RNA水解酶。
分子实验必须的。
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
花落一天
10年3个月前
7楼
[s:220] 超净台居然还有这个作用......................................离心机很脸熟,我们学校用的是同一个牌子的高速冷冻,移液器貌似也比较高级,楼主可以开一篇用来专门介绍仪器和药品............................比较有爱
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
hambaby
10年3个月前
8楼
引用第6楼atlas于2011-10-02 23:07发表的 :
……
180度8小时。
……
  


[s:225] [s:225] [s:225]

鄙局处理鸽子粪,105度48小时。
真是人比人得死,货比货得仍啊……
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
atlas作者
10年3个月前
9楼
回 8楼(hambaby) 的帖子
180度8小时的目的主要是为了除去RNA水解酶。
RNase A 在湿热灭菌锅中121度4小时,仍可保持活性。
所以一般来说,本实验室采用干热180度8小时来搞定
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
diy患者
10年3个月前
10楼
“基因组DNA为约12kb”

说法不是很严密,实际上利用琼脂糖电泳,超过20Kb的跑的一样快,所以分不出来超过20Kb的片段,而染色体片段是非常大的,在提取过程中会随机打断成非常大的片段,大部分会大于20kb,所以在电泳图上跑的和20Kb的一样快。

你们用的maker是什么marker,怎么跑得不清楚,其实用lamda噬菌体的酶切marker挺好的,价格便宜量又足。
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
diy患者
10年3个月前
11楼
你这个实验不是提取RNA吧,所以应该不需要这么麻烦,DNA很抗造的。有EDTA就成。
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
atlas作者
10年3个月前
12楼
回 10楼(diy患者) 的帖子
额。是这样的。。。
第一次编帖,内容很多的。你说的问题基本都说到了。但是,科创的速度不给力。第一次做的居然都丢了。由于时间来不及,就没有都补上。。。

后面几天有时间再补回来
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论
diy患者
10年3个月前
13楼
引用第8楼hambaby于2011-10-03 01:43发表的 :


[s:225] [s:225] [s:225]

鄙局处理鸽子粪,105度48小时。
.......  

为何要处理鸽子粪?这个时间太长了吧。怎么不温度高点,时间短点呢?
回复
评论
加载评论中,请稍候...
200字以内,仅用于支线交流,主线讨论请采用回复功能。
折叠评论

想参与大家的讨论?现在就 登录 或者 注册

所属专业
上级专业
atlas
学者 笔友
文章
163
回复
1993
学术分
16
2007/07/27注册,4 年前活动
Atlas_Biotech

西北农林科技大学

生物技术专业

生物搬砖博士生

研究方向: 金黄色葡萄球菌耐药性机制与耐药基因水平转移机制。

%7B%22isDisplay%22%3Atrue%7D
视频暂不能访问,请登录试试
仅供内部学术交流或培训使用,请先保存到本地。本内容不代表科创观点,未经原作者同意,请勿转载。
音频暂不能访问,请登录试试
文件下载
加载中...
{{errorInfo}}
{{downloadWarning}}
你在 {{downloadTime}} 下载过当前文件。
文件名称:{{resource.defaultFile.name}}
下载次数:{{resource.hits}}
上传用户:{{uploader.username}}
所需积分:{{costScores}},{{holdScores}}下载当前附件免费{{description}}
积分不足,去充值
文件已丢失

当前账号的附件下载数量限制如下:
时段 个数
{{f.startingTime}}点 - {{f.endTime}}点 {{f.fileCount}}
插入资源
全部
图片
视频
音频
附件
全部
未使用
已使用
正在上传
空空如也~
上传中..{{f.progress}}%
处理中..
上传失败,点击重试
等待中...
{{f.name}}
空空如也~
(视频){{r.oname}}
{{selectedResourcesId.indexOf(r.rid) + 1}}
处理中..
处理失败
插入表情
我的表情
共享表情
Emoji
上传
注意事项
最大尺寸100px,超过会被压缩。为保证效果,建议上传前自行处理。
建议上传自己DIY的表情,严禁上传侵权内容。
点击重试等待上传{{s.progress}}%处理中...已上传
空空如也~
草稿箱
加载中...
此处只插入正文,如果要使用草稿中的其余内容,请点击继续创作。
{{fromNow(d.toc)}}
{{getDraftInfo(d)}}
标题:{{d.t}}
内容:{{d.c}}
继续创作
删除插入插入
{{forum.displayName}}
{{forum.countThreads}}
篇文章,
{{forum.countPosts}}
条回复
{{forum.description || "暂无简介"}}
ID: {{user.uid}}
学术分隐藏
投诉或举报
加载中...
{{tip}}
请选择违规类型:
{{reason.type}}

空空如也

支持的图片格式:jpg, jpeg, png
插入公式
分享回复:{{shareId}}
加载中...
评论控制
加载中...
文号:{{pid}}
投诉或举报
加载中...
{{tip}}
请选择违规类型:
{{reason.type}}

空空如也

加载中...
详情
详情
推送到专栏从专栏移除
设为匿名取消匿名
查看作者
回复
只看作者
加入收藏取消收藏
加入关注取消关注
折叠回复
置顶取消置顶
评学术分
鼓励
设为精选取消精选
建议修改
编辑
通过审核
评论控制
退修或删除
历史版本
违规记录
投诉或举报
加入黑名单移除黑名单
查看IP
{{format('YYYY/MM/DD HH:mm:ss', toc)}}
投诉或举报
加载中...
{{tip}}
请选择违规类型:
{{reason.type}}

空空如也