CTAB & 液氮研磨法提取基因组DNA及其检测与ITS序列扩增
atlas 2011-10-2农业
CTAB & 液氮研磨法提取Phanerochaete chrysosporium真菌基因组DNA
提取步骤:
①打开水浴锅65℃,预热CTAB提取液。
②液氮研磨样本,分装入离心管,每管约60mg。
③每管加入700ul CTAB提取液,涡旋混合后,65℃水浴保温1h,每10min摇匀。后取出冰浴5min。
④加700ul酚氯醇(25:24:1),轻颠倒混匀30min。离心机设4℃, 12000rpm。
⑤离心10min。
⑥取上清600ul,加入氯醇(24:1)600 ul,轻颠倒混匀20min。
⑦离心10min。
⑧取上清550ul,加入氯醇(24:1)550 ul,轻颠倒混匀20min。
⑨离心10min。
⑩加入55ul(1/10体积)的3M NaAc(4℃)与330ul(6/10体积)的异丙醇(-20℃),颠倒混匀,-20℃沉纯过夜。

图:
液氮研磨:
IMG_1154.JPG

IMG_1157.JPG

IMG_1170.JPG

分装样本后 ,加入预热的CTAB提取剂
IMG_1194.JPG

  水浴保温:
IMG_1195.JPG

冰浴5min
IMG_1203.JPG

1h后加入酚、氯仿、异戊醇试剂:
IMG_1196.JPG

高速离心机。eppendorf品牌。值得信赖。
IMG_1057.JPG

氯仿、异戊醇试剂处理
IMG_1206.JPG

醇析出DNA后。在超净台强风干燥
IMG_1186.JPG
+1  学术分    虎哥   2011-10-02   希望了解实验的目的、意义
+20  科创币    wesker   2011-10-02   
来自 农业
 
2011-10-2 21:10:20
atlas(作者)
1楼
制备1%琼脂糖凝胶。电泳30min后。浸泡于EB。1h后取出。紫外呈像系统检测
IMG_1193.JPG

图中显示:Marker最后的条带为10kb,基因组DNA为约12kb,符合常规
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atlas(作者)
2楼
IMG_1176.JPG

使用Nanodrop检测
该样本DNA浓度为894ng/ul。OD260/280=2.12,OD260/230=2.07
未做纯化,混有RNA残留故 OD260/280值偏高。
做its序列的扩增并不需要高纯度。故不作纯化。

使用TaKaRa的Taq试剂盒
IMG_1199.JPG

PCR程序
  
搜狗截图_2011-10-02_21-27-18.png

PCR开始了
IMG_1208.JPG
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3楼
锡箔用来干啥?
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4楼
赞扬,大爱。。
想请楼主普及一下人民群众喜闻乐见的几个东西:
DNA亲子鉴定的原理、过程、方法;
DNA测序的方法和流程。
如果能用实验做一小段来说明,配合完整的综述就更好了。
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atlas(作者)
5楼
测序一般都是交给公司去测序的。
测序已有测序仪可以使用了。化学测序十分繁琐。很难一时半会儿讲的清楚。

本实验的目的是提取基因组DNA,并扩增ITS序列的实验操作练习。使用的是已知明确分类的Phanerochaete chrysosporium。
ITS序列是一段在种间具有广泛变异的序列,而两端的rDNA 片段相对保守。故利用rDNA 的保守片段,设计引物its1,its4可以克隆出its全部片段。比对NCBI的数据库,即可得到较为准确的分类学信息。是微生物研究的的必要之举。当然并不能完全依靠分子鉴定。还要结合电镜下的结构学分类信息来综合考量
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atlas(作者)
6楼
锡纸包裹研钵,放在干热灭菌锅中,180度8小时。灭菌,除去所有RNase A 等RNA水解酶。
分子实验必须的。
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2011-10-03 00:58:32
7楼
[s:220] 超净台居然还有这个作用......................................离心机很脸熟,我们学校用的是同一个牌子的高速冷冻,移液器貌似也比较高级,楼主可以开一篇用来专门介绍仪器和药品............................比较有爱
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8楼
引用第6楼atlas于2011-10-02 23:07发表的 :
……
180度8小时。
……
  


[s:225] [s:225] [s:225]

鄙局处理鸽子粪,105度48小时。
真是人比人得死,货比货得仍啊……
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atlas(作者)
9楼
回 8楼(hambaby) 的帖子
180度8小时的目的主要是为了除去RNA水解酶。
RNase A 在湿热灭菌锅中121度4小时,仍可保持活性。
所以一般来说,本实验室采用干热180度8小时来搞定
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10楼
“基因组DNA为约12kb”

说法不是很严密,实际上利用琼脂糖电泳,超过20Kb的跑的一样快,所以分不出来超过20Kb的片段,而染色体片段是非常大的,在提取过程中会随机打断成非常大的片段,大部分会大于20kb,所以在电泳图上跑的和20Kb的一样快。

你们用的maker是什么marker,怎么跑得不清楚,其实用lamda噬菌体的酶切marker挺好的,价格便宜量又足。
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11楼
你这个实验不是提取RNA吧,所以应该不需要这么麻烦,DNA很抗造的。有EDTA就成。
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atlas(作者)
12楼
回 10楼(diy患者) 的帖子
额。是这样的。。。
第一次编帖,内容很多的。你说的问题基本都说到了。但是,科创的速度不给力。第一次做的居然都丢了。由于时间来不及,就没有都补上。。。

后面几天有时间再补回来
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2011-10-04 11:24:03
13楼
引用第8楼hambaby于2011-10-03 01:43发表的 :


[s:225] [s:225] [s:225]

鄙局处理鸽子粪,105度48小时。
.......  

为何要处理鸽子粪?这个时间太长了吧。怎么不温度高点,时间短点呢?
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